1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN / T 52162020 商品化试剂盒检测方法 乳酸链球菌素 方法一 Commercial kit method Nisin Test Method ICS 67.050 C 53 2020-08-27 发布 2021-03-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 52162020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国乌鲁木齐海关、北京勤邦生物技术有限公司。 本标准主要起
2、草人：孟茹、周均、尚爽、罗琼、齐鑫、万宇平、梁振纲、高艳菲、牛娜。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 52162020 商品化试剂盒检测方法 乳酸链球菌素 方法一 1 范围 本标准规定了食品中乳酸链球菌素的酶联免疫检测方法。 本标准适用于检测含乳饮品及肉制品等食品中乳酸链球菌素 A 及乳酸链球菌素 Z 的含量。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2775 商品化食品检测试
3、剂盒评价方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳酸链球菌素 nisin 乳酸乳球菌发酵后提取而制得的食品添加剂乳酸链球菌素，是一种多肽物质，由 34 个氨基酸残 基组成。用于食品添加剂的有 Nisin A 和 Nisin Z 两种类型： Nisin A 的分子式为 C 140 H 230 O 37 N 42 S 7 ，相 对分子量为 3 354.35 Da ；Nisin Z 的分子式为 C 140 H 230 O 37 N 42 S 7 ，相对分子量为 3 330.31 Da。两种类型 的乳酸链球菌素分子结构在第 27 位的氨基酸不同， Nisin A 第 27 位氨基酸
4、为组氨酸， Nisin Z 第 27 位氨基酸为天冬酰胺。 4 方法提要 样品中的乳酸链球菌素和试剂盒中微孔条上预包被的抗原竞争乳酸链球菌素抗体，加入酶标二 抗后，用底物显色液显色，样本吸光值与所含乳酸链球菌素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以 其对应的稀释倍数，即可得出样品中乳酸链球菌素的含量。 5 材料和试剂 除另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1 乳酸链球菌素检测试剂盒。试剂盒评价参见 SN/T 2775，具体评价结果参见附录 A。试剂盒组成 如下： a） 96 孔酶标板：12 条 8 孔（包被偶联抗原）； 以正式出版文本为准 2 SN/T
5、52162020 b） 乳酸链球菌素标准品：0 mg/L 、0.1 mg/L 、0.5 mg/L 、2.5 mg/L 、12.5 mg/L 、62.5 mg/L ； c） 高浓度标准品：100 mg/L ； d） 酶标记物浓缩液； e） 抗体工作液； f） 浓缩清洗液； g） 样品提取液； h） 显色液：底物 A、底物 B； i） 终止液。 试剂盒应在 4 8 避光条件下保存，溶解后的酶标记物应在 -15 条件下冻存。 5.2 盐酸。 5.3 氢氧化钠。 5.4 正己烷。 6 仪器 6.1 天平：量程 100 g, 感量 0.01 g。 6.2 酶标仪：波长 450 nm。 6.3 涡旋仪。
6、6.4 离心机。 6.5 混合振荡器。 6.6 单道移液器： 20 L200 L、 100 L1 000 L、 500 L5 000 L。 6.7 多道移液器： 30 L300 L。 6.8 聚苯乙烯离心管： 2 mL、 10 mL、 50 mL。 6.9 研钵或粉碎装置。 7 试样的制备和提取 7.1 牛奶、饮料类液体样品：用样品提取液将样本稀释 10 倍，取 50 L 用于分析。样品稀释倍数为 10。 7.2 乳制品、肉制品类固体样品：称取 25 g（精确到 0.01 g）样品，用研钵或粉碎装置将样品制成 粉末状或直径小于 0.3 mm 的颗粒状，称取 1 g（精确到 0.01 g）粉末状
7、制备好的样品至 50 mL 离心管 里，加入 5 mL 样品提取液，旋涡振荡混匀 5 min，3 000 r/min 离心 5 min 后静置 10 min，提取上清 1 mL 至离心管里 ( 注意不要吸到表层的油脂和底层的沉淀 )，取 50 L 用于分析。样品稀释倍数为 5。 8 分析步骤 8.1 操作条件 所有操作应在室温下（ 20 25 ）进行，乳酸链球菌素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至 室温后方可使用。 8.2 洗板条件 8.2.1 人工洗涤次数 4 次，每次注入洗涤工作液 250 L/ 孔。 8.2.2 自动洗板预定 4 次。 8.3 酶标仪测定条件 以正式出版文本为准 3 SN/
8、T 52162020 酶标仪测定波长为 450 nm。 8.4 测定步骤 8.4.1 将测定需用的微孔板条插入微孔架上，标记标准液和样品等在微孔架上的位置。 8.4.2 吸取 50 L乳酸链球菌素标准工作溶液（浓度分别为： 0 mg/L、0.1 mg/L 、0.5 mg/L 、2.5 mg/L 、 12.5 mg/L、62.5 mg/L ）和样品溶液于对应的微孔中。 8.4.3 每孔加入 50 L 抗体工作液，振荡混匀，用封孔膜封孔条，置 37 避光环境中反应 30 min。 8.4.4 揭开封孔膜，倒掉孔中的溶液，加洗涤工作液，按 8.2 条件进行洗板。将微孔架反扣在吸水纸 上反复拍打，除去
9、孔内残留的洗涤工作液。 8.4.5 吸取 100 L 酶标记结合物溶液到每个微孔中，振荡混匀，用封孔膜封孔后置 37 避光环境 中反应 30 min，重复 8.4.4 洗涤微孔。 8.4.6 吸取 100 L 显色液到每个微孔中，振荡混匀，用封孔膜封孔后置 37 避光环境中反应 15 min。 8.4.7 吸取 100 L 终止液到每个微孔中，振荡混匀，将微孔架置于酶标仪中，在 450 nm 处测量吸 光度 OD 值。 8.5 平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。 8.6 空白试验 除不称取试样外，用水做空白按 8.4 测定步骤进行。 9 结果计算 9.1
10、读取 OD 值，按（1）计算每一标准溶液和样品的百分吸光度值（B）： 百分吸光度值 B=B 1 /B 0 100% （1） 式中 ： B 1 标准品或样品溶液的平均吸光度值； B 0 0 mg/L 标准溶液的平均吸光度值。 9.2 以标准品百分比吸光度值为纵坐标（ %），乳酸链球菌素标准溶液浓度（ mg/L）为横坐标，绘制 标准工作曲线，将样品的百分吸光度代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的乳酸链球菌素 的浓度后，结果按式（2）计算： X=c V （2） 式中： X样品中乳酸链球菌素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c 从标准工作曲线上得到的样品中乳酸链球菌素浓度，单位为毫克每
11、毫升（mg/L）； V样品的稀释倍数。 也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算，所得结果表示至一位小数。 9.3 若样品 B 值高于标准工作溶液的 B 值范围，应对样品进行稀释后重新测试。 以正式出版文本为准 4 SN/T 52162020 10 确证试验 如被测样品中乳酸链球菌素含量大于限量要求，应用其他方法进行确证。 11 方法性能指标 11.1 检出限和定量限 检出限 2.0 mg/kg（mg/L ）；定量限 6.0 mg/kg（mg/L ）。 11.2 交叉反应率 乳酸链球菌素 100% ；纳他霉素 0.1% ；苯甲酸钠 0.1% ；聚萘氨酸 0.1% ；山梨酸钾 0.1% ； 对羟
12、基苯甲酸 0.1% ；多粘菌素 B1% ；多粘菌素 E1% ；万古霉素 1% ；缬氨霉素 1% ；平阳霉 素 1% ；环孢菌素 A1%。 11.3 回收率 11.3.1 牛奶、饮料、乳制品（液态）回收率如下： 添加量为 1 g/mL 时，回收率为 78.6%110.6% ； 添加量为 30 g/mL 时，回收率为 98.7%117.9% ； 添加量为 300 g/mL 时，回收率为 79.4%116.5%。 11.3.2 肉制品、乳制品（固态）回收率如下： 添加量为 0.5 g/mL 时，回收率为 93.1%105.9% ； 添加量为 10 g/mL 时，回收率为 75.8%116.3% ；
13、添加量为 100 g/mL 时，回收率为 88.2%112.4%。 以正式出版文本为准 5 SN/T 52162020 附录 A （资料性附录） 乳酸链球菌素检测试剂盒评价结果 1） A.1 线性：乳酸链球菌素的线性相关系数 R 0.96。 A.2 乳酸链球菌素 100% ；纳他霉素 0.1% ；苯甲酸钠 0.1% ；聚萘氨酸 0.1% ；山梨酸钾 0.1% ； 对羟基苯甲酸 0.1% ；多粘菌素 B1% ；多粘菌素 E1% ；万古霉素 1% ；缬氨霉素 1% ；平阳霉 素 1% ；环孢菌素 A1%。 A.3 检出限：2.0 mg/L 或 mg/kg。 A.4 定量限：6.0 mg/L 或 m
14、g/kg。 1）本评价结果仅适用于北京勤邦生物技术有限公司的乳酸链球菌素快速检测试剂盒。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 16 千字 2020年9月第一版 2020年9月第一次印刷 印数1500 书号：155175105 定价 16.00元 商品化试剂盒检测方法 乳酸链球菌素 方法一 行 业 标 准 SN/T52162020 * * * SN/T 5216 2020 北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
