1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5192 2020 代替 SN/T 11622002 嗜皮菌病检疫技术规范 Quarantine protocol for dermatophilosis 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 11.220 CCS B 41 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5192 2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国长沙海关。 本文件
2、主要起草人：朱来华、朱可、唐连飞、张金玲、郑小龙、王群、孙涛、邓明俊、张晓文、 姜帆、王宫璞、辛学谦。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5192 2020 嗜皮菌病检疫技术规范 1范围 本文件规定了嗜皮菌病的临床诊断、病原分离鉴定、分子生物学鉴定技术和血清学试验等检疫 技术。 本文件适用于动物嗜皮菌病的检疫和诊断。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 14926.43实验动物细菌学检测染色法、
3、培养基和试剂 GB 19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4生物安全措施 试验环境和防护要求见 GB 19489。 5临床诊断 5.1器材及消毒药物 5.1.1器材 工作服、乳胶手套、线手套、防护面具、口罩、风镜、反光镜、手电筒、煮沸消毒器、脸盆、 耳夹子。 5.1.2消毒药物 0.1% 升汞水、2.5% 来苏尔、0.1% 新洁尔灭或 75% 酒精棉球等。 5.2检查方法 5.2.1 检查者及助手均应穿工作服，戴好乳胶手套、口罩、风镜及防护面具，选择适当位置，对保定 好的动物进行检查。 5.2.2 检查头部（尤其是唇部）、颈部、背部、胸腹部、四肢、会
4、阴部、尾部是否出现浅表渗出性、局 限性的角质皮疹或硬痂。 5.2.3 检查结束，脱掉手套，检查者及助手的手需用 0.1% 升汞水或 2.5% 来苏尔或 0.1% 新洁尔灭或 以正式出版文本为准 2 SN/T 5192 2020 75% 酒精棉球彻底消毒，工作服及用过的器材分别用 2.5% 来苏尔等浸泡 1 h，或煮沸 10 min 消毒。检 疫现场用 10% 石灰乳、2% 热火碱水或 10%20% 漂白粉水溶液消毒。 5.3临床特征 出现特征性临床症状，如体表皮肤或黏膜出现渗出性皮炎、皮疹或硬痂，即可初步判定。 5.4判定 根据临床特征（见 5.3）可做出初步诊断。进一步确诊应采集病料或血清样
5、品进行实验室检查。 6病原分离与鉴定 6.1材料准备 6.1.1器材 组织捣碎机、恒温水浴箱、恒温生化培养箱、普通冰箱及低温冰箱（4 、-20 ）、离心机及离 心管、普通生物显微镜、荧光显微镜、擦镜纸、手术刀、镊子、微量移液器、胶头滴管、载玻片、盖 玻片、接种环、酒精灯。 6.1.2培养基与试剂 甲醛、多粘菌素 B、PBS（0.1 mol/L pH7.2），见附录。 绵羊鲜血琼脂培养基（平板）或血清肉汤培养基（试管）、革兰氏染色液、姬姆萨染色液，按 GB/T 14926.43 规定配制。 6.2样品采集和运送 6.2.1样品采集 从病变部位无菌采集痂皮和痂皮下渗出液等病料。 6.2.2样品运送
6、 在低温条件（2 8 ）下，样品尽快（24 h48 h 内）送往实验室。 6.3病料涂片或压片镜检 新剥离的新鲜、湿润痂皮可直接在载玻片上压印而制成压片；硬变痂皮或风干痂皮在 PBS 中浸 泡过夜使其充分湿润，然后将其紧压在载玻片上压印而制成压片。痂皮下渗出液，用接种环勾取在载 玻片上涂布而制成涂片。 6.4病原分离培养 取制备好的绵羊鲜血琼脂培养基（平板）或血清肉汤培养基（试管），无菌操作将采集的样品用 接种环勾取痂皮下渗出液，或切取小块痂皮（1 cm1 cm），用 PBS 反复冲洗 5 次后，用组织捣碎机 乳化制成 10% 悬液，接种于培养基，每个样品接种 2 个平板或试管。如悬液经 0.
7、45 nullm 滤膜过滤， 可充分减少或消除污染，或在培养基中加入 1 000 U/mL 多粘菌素 B 以抑制污染菌生长。 将接种好的平板或试管置 37 恒温培养，最初 24 h 应检查是否有杂菌污染。24 h 后就每天观察， 培养 4 d7 d。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5192 2020 6.5病原鉴定 6.5.1菌落鉴定 观察培养基上有无疑似特征性菌落。肉汤培养基形成菌膜。在平板上培养 24 h48 h 后，在培养 基上形成有溶血的、黄灰色的、粗糙型菌落（直径大约 1 mm）。72 h 后常出现淡黄色光滑型菌落。粗 糙型菌落是由分枝菌丝形成的，光滑型菌落是由球状菌形成的。 6
8、.5.2革兰氏染色鉴定 6.5.2.1革兰氏染色鉴定按 GB/T 14926.43 规定操作。 6.5.2.2 结果判定：本菌为革兰氏阳性菌，呈紫色。镜检寻找分枝及多隔的菌丝或平行排列的革兰阳 性球菌样细胞丛。 6.5.3姬姆萨染色鉴定 6.5.3.1姬姆萨染色鉴定按 GB/T 14926.43 规定操作。 6.5.3.2 结果判定：菌体呈分隔的分枝状长菌丝，并横向分裂成多排球杆菌或卵圆状球菌，刚果 嗜皮菌染色较深，因此深染的刚果嗜皮菌与角质细胞或嗜中性细胞的浅色或粉色复染背景形成反 差，更容易区分厚涂片中的刚果嗜皮菌。对疑似菌需要进行下一步的 PCR 检测或者免疫荧光检查 进行确诊。 6.5
9、.4生理生化鉴定 6.5.4.1生理生化鉴定按 GB/T 14926.43 规定操作。 6.5.4.2生理生化鉴定结果，见附录 B。 7分子生物学鉴定技术 7.1材料与试剂 7.1.1仪器与器材 PCR检测仪，高速台式冷冻离心机（离心速度12 000 r/min以上），台式离心机（离心速度2 000 r/min）， 混匀器，冰箱（2 8 和 -20 两种），微量可调移液器（10 nullL、100 nullL、1 000 nullL）及配套带滤 芯吸头，eppendorf 离心管（1.5 mL 带盖塑料离心管），稳压、稳流电泳仪和水平电泳槽，电泳凝胶成 像系统（或紫外分析仪）。 7.1.2引物
10、 加灭菌蒸馏水配制成 20 nullmol/L 工作液。PCR 引物序列见表 1。 表 1PCR 引物序列 名称 序列 上游引物 FP 5-ACATGCAAGTCGAACGATGA-3 下游引物 RP 5-ACGCTCGCACCCTACGTATT-3 7.1.3试剂 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5192 2020 蛋白酶 K、10%SDS 液、苯酚、三氯甲烷、异丙醇（-20预冷）、3 mol/L 的 NaAc、75% 乙醇、 Taq 酶（5 U/ nullL）、10PCR 缓冲液、dNTPs（含有 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 1
11、0 mmol/L）、电泳 缓冲液（0.5TBE 缓冲液）、EB、电泳加样缓冲液、0. 1 mol/L PBS（pH 8.0），见附录 C。 7.2DNA 模板的制备 7.2.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、阴性 对照在试剂盒中已标出），编号。 7.2.2 每管加 pH 7.0 PBS 1 mL，从分离培养后的培养基挑取单个疑似特征性菌落，混匀于 PBS 中，于 4 15 000 r/min 离心 1 min，去上清液。 7.2.3沉淀重悬于 50 nullL 蒸馏水，煮沸 10 min，于 4 C 15 000 r/min 离
12、心 3 min，去沉淀，上清液转移至 新离心管中。 7.2.4每管加入蛋白酶 K 至终浓度 100 nullg /mL 和 SDS 至终浓度 10 mg/mL，55 水浴 2 h。 7.2.5 每管分别加入苯酚、苯酚三氯甲烷异戊醇混合液（体积比为 25241）、三氯甲烷各抽提 1 次，吸取水相转移至新离心管中。 7.2.6 每管加入 1/10 体积 3 mol/L 的乙酸钠和 2.5 倍体积的无水乙醇，轻轻混匀后置 -20 沉淀 1 h , 4 条件下 12 000 r/min 离心 15 min，弃掉上清液。 7.2.7每管加入 75% 乙醇洗涤，4 条件下 12 000 r/min 离心
13、5 min，沉淀烘干后悬浮于灭菌的 20 nullL超 纯水中，取适量用作 PCR 模板。若需长期保存应放置 -70 冰箱中。 7.3PCR 反应 PCR 反应液组成如下： 10PCR 缓冲液 5 nullL 25 mmol/L 的 MgCl 2 4 nullL dNTP（2.5 mmol/L） 4 nullL 引物 PF（20 nullmol/L） 1 nullL 引物 PR（20 nullmol/L） 1 nullL Taq 酶（5 U/ nullL） 0.5 nullL DNA 模板（10 ng/ nullL） 2 nullL 灭菌水 32.5 nullL 在 PCR 管内加入上述成分，
14、总体积为 50 nullL，3 000 r/min 离心 10 s。 将 PCR 反应管置于 PCR 扩增仪。先 95 预变性 2 min，再进行 94 变性 30 s、60 退火 30 s、 72 延伸 60 s，35 个循环，然后 72 延伸 10 min，最后 4 保温。 7.4对照设立 从DNA抽提开始，设立阳性对照、阴性对照。以含有已知刚果嗜皮菌NCTC 11184株（美国 ATCC）的细菌悬液作为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。 7.5PCR 产物琼脂糖电泳 用 TBE 电泳缓冲液配制 1的琼脂糖（含 0.5 nullg/mL EB）平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳 缓冲液刚好淹没
15、胶面。将 8 nullL 样品和 2 nullL 样品缓冲液混匀后加入样品孔。在电泳时设立 DNA 标准 分子量作对照。5 V/cm 电泳约 30 min，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察结果。 7.6结果判定 阳性对照会出现一条 500 bp 的 DNA 片段，而阴性对照没有该核酸带，则试验成立。如果样品出 以正式出版文本为准 5 SN/T 5192 2020 现 500 bp 的 DNA 片段，则判为阳性，其他情况判为阴性。 出现阳性扩增片段时，需要对扩增产物进行序列测定。 8血清学鉴定技术 8.1荧光抗体试验 8.1.1试验器材 恒温培养箱、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、玻璃铅笔、接
16、种环、镊子、染色缸。 8.1.2试验试剂 PBS-T（0.1 mol/L pH7.2）、甘油缓冲液、丙酮乙醇（按体积比 11 混匀，-20 预冷）、生理 盐水 标准抗原、标准阳性血清、标准阴性血清、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗抗体等由国家指 定单位提供，按说明书使用。 8.1.3操作程序 8.1.3.1 制备抗原玻片，用玻璃铅笔在载玻片上画定区域（直径 0.5 cm），病料按 5.2 和 5.3 直接涂片或 压片，或用接种环在琼脂培养基上钩取单个菌落，涂布均匀，制成薄涂片，风干。 8.1.3.2滴加预冷丙酮乙醇，固定细胞 5 min10 min ；用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 5
17、min，甩干。 8.1.3.3加 100 nullL 封闭液，使之布满整个标本，在 37 孵育 30 min，甩干；用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 5 min，甩干。 8.1.3.4加标准血清 50 nullL，置湿盒中 4 孵育过夜；PBS-T 洗涤 3 次，每次 5 min，甩干。 8.1.3.5 加入工作浓度的异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗抗体，使之布满整个标本，在 37 湿盒中孵 育 30 min ；PBS-T 洗涤 3 次，每次 5 min，甩干。 8.1.3.6在标本处滴一小滴缓冲甘油液，轻轻加上盖玻片，用荧光显微镜检查。 8.1.3.7将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光
18、源进行观察。 8.1.3.8 结果判定：将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源即可观察。阳性反应者 FITC 荧光色 素呈明亮的黄绿色荧光。阴性反应则没有相应的荧光出现。 8.2酶联免疫吸附试验 8.2.1器材 96 孔酶标板、可调移液器、恒温培养箱、电子天平、酶标仪。 8.2.2试剂 包被缓冲液、洗涤缓冲液（PBS-T）、稀释液、底物缓冲液（使用前配制）、终止液。 标准抗原、标准阴性血清、标准阳性血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗抗体等由国家指定 单位提供，按说明书使用。 8.2.3操作方法 8.2.3.1用纯化培养的细菌培养物，稀释成 1100 悬液，每孔加 l00 nullL 包被
19、酶标板，放置 4 过夜孵育。 8.2.3.2用 PBS-T 洗涤酶标板 3 次，每次 5 min。 8.2.3.3每孔加入 100 nullL 封闭液，于 23 25 轻轻振荡，在湿盒中孵育 30 min。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5192 2020 8.2.3.4用 PBS-T 洗板 3 次，每次 5 min。 8.2.3.5 将待检血清（见附录 D）用稀释液 140 稀释，加入 100 nullL，将酶标板置湿盒中 37 振荡孵 育 1 h。每个血清稀释度做 2 个平行对照，同时设阳性血清对照和阴性血清对照。 8.2.3.6用 PBS-T 洗板 3 次，每次 5 min。 8.2
20、.3.7取工作浓度的 HRP 标记的抗抗体，每孔加入 100 nullL，于 23 25 轻轻震荡孵育 30 min。 8.2.3.8用 PBS-T 洗板 3 次，每次 5 min。 8.2.3.9每孔加入 100 nullL 底物缓冲液，温育 60 min。 8.2.3.10每孔加入 100 nullL 终止液，用酶标仪在波长 450 nm 处读取光吸收值。 8.2.4结果判定 8.2.4.1 S （ S OD -NC x ） P （ PC x -NC x ） 式中： S OD 样品 OD 平均值； NC x 阴性对照 OD 平均值； PC x 阳性对照 OD 平均值。 8.2.4.2当 S
21、/P 大于或等于 0.5，则判为 ELISA 抗体阳性。 8.2.4.3当 S/P 小于 0.5，则判为 ELISA 抗体阴性。 8.2.4.4根据 ELISA 结果判定，可初步判定为血清学阳性。 9综合判定 根据 5.4、6.5.3.2，结合 7.6、8.1.3.8 或 8.2.4.4 做出确诊。 以正式出版文本为准 7 SN/T 5192 2020 附录A （规范性） 培养基和试剂的配制 A.1多粘菌素培养基 绵羊鲜血琼脂培养基（平板）或血清肉汤培养基（试管），按 GB/T 14926.43 规定配制。 121 高压灭菌 15 min，置于室温，待培养基冷却 50 时加入 1 000 U/
22、mL 多粘菌素 B 溶液，混 匀后倾注无菌平皿或试管，凝固或冷却到室温后用保鲜袋包装后置 4 保存，1 周内使用完毕。 A.20.1 mol/L pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS） 称取 71.63 g 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 12H 2 O），加蒸馏水溶解，定容至 1 000 mL，制成 0.2 mol/L 磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）母液。 称取 31.20 g 磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 2H 2 O），加蒸馏水溶解，定容至 1 000 mL，制成 0.2 mol/L 磷 酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）母液。 量取 0.2 mol/L 磷酸氢二钠（Na 2
23、HPO 4 ）母液 72 mL 和 0.2 mol/L 磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）母液 28 mL，加蒸馏水 100 mL，混匀。 A.3洗涤缓冲液（PBS-T） PBS 1 000 mL，吐温 -20 0.5 mL，混匀。 A.4封闭液 牛血清白蛋白（BSA）3 g5 g 溶于 100 mL 的 PBS 中 。 A.5稀释液（PBS-T-BS） PBS-T 100 mL，牛血清白蛋白（BSA） 2.0 g，混匀。 A.6稀释液（PBS-T-BS） PBS-T 100 mL，牛血清白蛋白（BSA） 2.0 g，混匀。 A.7底物溶液 甲液： 柠檬酸（C 6 H 8 O 7 H 2 O
24、） 21.01 g，加蒸馏水至 1 000 mL。 乙液： 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 12H 2 O） 71.64 g，加蒸馏水至 1 000 mL。 甲液与乙液按 9.710.3 的比例混合成 pH 5.0 的柠檬酸磷酸盐缓冲液。 底物溶液在临用前按如下比例配制： ABTS 1 mg 柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH5.0） 2 mL 3 H 2 O 2 4 nullL 以正式出版文本为准 8 SN/T 5192 2020 附 录 B （规范性） 生理生化鉴定结果 糖发酵试验 结果 其他试验 结果 葡萄糖 + 三糖铁试验 + 果糖 + 淀粉水解试验 + * 蔗糖 + * 明胶液化试验 + *
25、 肌醇 + 紫乳试验 + 木糖 + 酪蛋白水解试验 + 麦芽糖 - 枸橼酸盐还原试验 + 水杨苷 - 触酶试验 + 甘露醇 - 脲酶试验 - 甘露糖 - MR 试验 - 山梨醇 - VP 试验 - 棉子糖 - H 2 S 试验 - 乳糖 - 吲哚试验 - 半乳糖 - 硝酸钾还原试验 - 注： + 表示结果为阳性，- 表示结果为阴性，+ 表示部分阳性，* 表示部分阳性。 以正式出版文本为准 9 SN/T 5192 2020 附录C （规范性） PCR 试剂配制方法 C.1蛋白酶 K（10 mg/mL） 蛋白酶 K 50 mg 蒸馏水 5 mL 50 mg 蛋白酶 K 溶于 5 mL 蒸馏水中，分
26、装成每管 1 mL，-20 保存。 C.210% SDS SDS（十二烷基磺酸钠） 100 g 蒸馏水 1 000 mL 100 g SDS 在 900 mL 水中溶解，加热至 68 助溶，加水定容至 1 000 mL，室温保存。 C.3酚三氯甲烷异戊醇抽提液 将饱和酚三氯甲烷异戊醇按 25241 体积比混合，密闭避光保存。 C.43 mol/L 乙酸钠 408 g 乙酸钠（NaAc3H 2 O），在 900 mL 水中溶解，加水定容至 1 000 mL，室温保存。107.9 kPa/ 121 高压灭菌 15 min。 C.575% 乙醇 蒸馏水 75 mL 无水乙醇 25 mL 用无水乙醇和
27、蒸馏水充分混匀，-20预冷。 C.65TBE 电泳缓冲液（5 浓缩液） Tris 54.0 g 硼酸 27.5 g EDTA 2.9 g 加三蒸水到 1 000 mL 用 5 mol/L 的盐酸（HCl）调到 pH 8.0，或直接购买商品化的产品。 C.7EB（核酸染色剂） 溴化乙锭（EB） 100 mg 蒸馏水 10 mL 以正式出版文本为准 10 SN/T 5192 2020 用三蒸水配制成 10 mg/mL 的浓缩液，使用时每 10 mL 琼脂溶液中加 1 nullL。 C.8加样缓冲液（6） 溴酚蓝 0.25 g 蔗糖 40 g 蒸馏水 100 mL 称取溴酚蓝 0.25 g 和蔗糖
28、40 g，充分溶解于 80 mL 蒸馏水，最后定容至 100 mL。107.9 kPa/121 高压灭菌 15 min。 以正式出版文本为准 11 SN/T 5192 2020 附录D （规范性） 被检血清的采取与处理 在被检牲畜颈前三分之一处静脉沟部位剪毛消毒采血。 采出的血液，冬季应放置室内防止血清冻结，夏季应放置阴凉之处并迅速送往实验室。如在 72 h 内不能送到，应先将血清倒入另一灭菌试管内，按比例每 1 mL 血清加入 12 滴 5% 石炭酸生理盐水 溶液，以防腐败。运送时使试管保持直立状态，避免振动。 动物血清在 56 水浴灭活 30 min。骡、驴、骡驴血清在 1 ： 5 稀释后置 63 水浴灭能 30 min。 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 27 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517535 定价 18.00 元 嗜皮菌病检疫技术规范 行 业 标 准 SN/T 51922020 * * * SN/T 5192 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
