1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5193 2020 兔球虫病检疫技术规范 Quarantine protocol for rabbit coccidiosis 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 30 千字 2021 年 1 月第一版 2021 年 1 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175130 定价 18.00元 兔球虫病检疫技术规范 行 业 标 准 SN/T
2、51932020 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194 242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 I 前言 本文件按照 GB/T 1.12010 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国太原 海关。 本文件主要起草人：吕继洲、袁向芬、张舟、吴绍强、邓艳、王彩霞、巩红霞、张永宁。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 1 兔球
3、虫病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了兔球虫病检疫时的样品采集、病原形态学观察以及 PCR 检测等技术规范。 本文件适用于活兔、带肝脏兔胴体球虫感染情况的检测，也适用于兔养殖场兔球虫病的流行病 学调查和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规模和试验方法 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 DNA ：脱氧核糖核酸（Deoxyribonuc
4、leic Acid） PCR ：聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction） SDS ： 十二烷基硫酸钠（ SodiumDodecylSulfate） 4 疫病概述 参见附录 A。 5 材料 5.1 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到 GB/T 6682 中一级水的要求。 5.2 基因组 DNA 抽提试剂盒、PCR 缓冲液、dNTP、DNA 聚合酶、DNA Marker、蛋白酶 K、氯化钠、 重铬酸钾、三氯甲烷、SDS、异丙醇、琼脂糖、无水乙醇等，均为商品化试剂。 5.3 饱和氯化钠溶液、2.5% 重铬酸钾溶液、0.5%SDS消化液、裂解液、20 mg
5、/L蛋白酶K溶液、 酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇溶液、70% 乙醇、3 mol/L乙酸钠溶液、电泳缓冲液、生理盐水的配制方 法见附录 B。 5.4 艾美耳球虫 Eimeia spp. 通用引物：ITS1-F ：5 -GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3 ； ITS1-R ： 5-CTGCGTCCTTCATCGAT-3。引物合成后均采用灭菌 ddH 2 O 稀释为 10 mol/L（具体序列见 附录 C）。 5.5 PCR 检测阴阳性对照：阳性对照为 11 种兔球虫 DNA 基因组中的一种，阴性对照为健康兔肝 （肠）组织样品。 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 2 6 仪器设
6、备与耗材 天平、镊子、载玻片、漂浮管、自封袋、60目小铜筛、显微镜、制冰机、冰箱（4 、-20 、- 80）、高压灭菌器、冷冻离心机、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像仪或紫外透射仪、微量可调移液器及 吸头、1.5 mL 离心管等。 7 检测方法 7.1 样品采集 7.1.1 肝脏、肠病灶样品采集 切取肝脏结节病灶、肠粘膜结节病灶组织，每份 20 g 左右，装入干净的自封袋中，标明编号， 记录兔的年龄、品种、饲养卫生条件等，置 4 保存，待处理镜检。 7.1.2 活兔粪便样品采集 活兔隔离检疫期 30 d，隔离第 1 天和隔离第 12 天分别采集兔子粪便两次。 取样前，先将一层保鲜膜铺在兔笼下面。
7、3 h 后从保鲜膜上取样，不管兔日龄大小，以兔个体为 单位，采集新鲜粪便一份 20 g 左右。装入干净的自封袋中，标明编号，记录兔的年龄、品种、健康 状况、用药、饲养卫生条件等情况，置 4保存，待处理镜检。 7.2 形态学鉴定 7.2.1 肝脏、肠病灶镜检 肝组织镜检可见肝细胞萎缩，胆管上皮增生，呈乳头状突起，上皮细胞变性坏死。肝脏组织结节 压片可见大量的球虫卵囊。 肠粘膜坏死脱落，肠粘膜涂片检查可见球虫卵囊。 7.2.2 活兔粪便的处理与镜检 7.2.2.1 每份粪样称取 3 g，用玻璃棒捣碎后与 50 ml 生理盐水搅成混悬液。 7.2.2.2 将粪便混悬液经60目小铜筛过滤到第二个容器内
8、，并将第二个容器内的过滤液倒入离心管中。 7.2.2.3 3000r/min 离心 3 min，弃去上清液。 7.2.2.4 向沉淀中加入 10 ml 饱和氯化钠溶液，充分混匀。 7.2.2.5 3000r/min 离心 3 min。 7.2.2.6 用捞网捞取表面浮液抖落于盛水的容器中。 7.2.2.7 将卵囊转入已加有 2.5% 重铬酸钾溶液的培养皿中，混匀，液面高度小于 1 cm，做好标记， 放置于 28 摇床内孢子化培养 48 h72 h，每隔 12 h 观察孢子化情况，孢子化率达到 80% 以上，收 集卵囊放于 4 冰箱保存。 7.2.3 形态特征 将卵囊置于载玻片上，100 倍光学
9、显微镜下观察，卵囊呈卵圆形或近似圆形，少数呈椭圆形或梨 形，形态随虫种而定，囊膜壁较厚，一般有两层，能明显看到蛋壳状结构，无色、淡黄色、金黄色 等。在 100 倍光学显微镜下对卵囊定位后，在 400 倍光学显微镜下进一步观察卵囊形状和结构。 兔艾美耳球虫卵囊模式图及 11 种兔球虫卵囊的形态特征见附录 D。 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 3 7.3 PCR 检测 7.3.1 PCR 引物 本方法所使用的引物序列如下： Eimeiaspp.ITS1-F ：5-GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3 Eimeiaspp.ITS1-R ：5-CTGCGTCCTTCATCGAT-
10、3 7.3.2 样品制备 取兔球虫卵囊（或病灶组织）沉淀25 mg置于离心管 按照附录E中提取组织DNA的方法提取 DNA，也可采用商品化的组织 DNA 提取试剂盒。 7.3.3 PCR 反应体系 取2 L 提取的样品 DNA 作为模板，加入按照表 1 配制的 PCR 反应液中。同时设立阴阳性对照， 设立 ddH 2 O 为空白对照。 表 1PCR 反应液的配制（等效化试剂可用） 组分 每管用量 / L 10PCR 缓冲液（含 Mg 2+ ） 2.5 dNTPMixture（2.5 mmol/L） 2 DNAtaq 聚合酶（1 U/L） 0.5 EimeriasppITS1-F 1 Eimer
11、iasppITS1-R 1 灭菌蒸馏水 16 模板 DNA 2 总体积 25 7.3.4 PCR 反应程序 94预变性 2 min ；94 变性 1 min，58 退火 1 min，72 延伸 1 min，32 个循环；最后 72 延伸 7 min ；4 保存。 7.3.5 琼脂糖电泳 取 5 LPCR 扩增产物，进行 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪或者紫外透射 仪观察结果。 7.3.6 结果判定 7.3.6.1试验成立的条件 阳性对照扩增有目的条带，且经测序比对后其同源性最近序列指向的兔球虫虫种与阳性对照所 属兔球虫虫种一致，阴性对照无相应片段。否则试验无效。 7.3.
12、6.2可疑判定 样品有扩增条带，判定样品为兔球虫感染可疑。 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 4 7.3.6.3阴性判定 样品无扩增条带，判定样品为兔球虫感染阴性。 7.3.6.4阳性判定 样品有扩增条带，将扩增获得的产物或电泳条带纯化后，直接测序或进行 T 载体克隆测序 。 将测序获得的序列与 Genbank 数据库中的序列进行 BLAST 分析比对，如果同源性最近序列指向 某种兔球虫，可判定样品为该兔球虫感染阳性；如果同源性最近序列指向与各种兔球虫均无关的序 列，则判定样品为兔球虫感染阴性。 8 结果综合判定 8.1 可疑判定 PCR 检测时，样品有扩增条带，判定样品可疑。
13、8.2 确诊判定 在肝组织或肠粘膜中镜检发现球虫卵囊，根据形态学鉴定感染种类，卵囊形态特征可疑的样品 提取 DNA 进行 PCR 扩增，根据 PCR 结果及测序比对分析结果进行感染情况判定。 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 5 附录A （资料性） 兔球虫病 兔球虫病是家兔中最常见的也是危害最严重的寄生虫病，主要是由寄生在肠道和胆管上皮细胞 的艾美耳属球虫引发的。世界各地已报道的可寄生于兔的艾美耳球虫有十几种，目前被公认的艾美耳 球虫（ Eimeria）有 11 种：包括小型艾美耳球虫（ E. exigua）、盲肠艾美耳球虫（ E. coecicola）、斯式 艾美耳球虫（ E.
14、 stiedai）、肠艾美耳球虫（ E. intestinalis）、维氏艾美耳球虫（ E.vejdovskyi）、中型艾美 耳球虫（ E. media）、梨型艾美耳球虫（ E. piriformis）、穿孔艾美耳球虫（ E. perforans）、无残艾美耳 球虫（ E. irresidua）、黄艾美耳球虫（ E. flavescens）、大型艾美耳球虫（ E. magna）。 根据球虫的寄生部位可分为肠型、肝型和混合型 3 种。开始时病兔食欲减退、精神沉郁、伏卧不 动、生长停滞。眼鼻分泌物增多，体温升高，腹部胀大，臌气，下痢，肛门沾污，排粪频繁。肠球虫 病症状有顽固性下痢，甚至拉血痢，或便
15、秘与腹泻交替发生。肝球虫病症状则为肝脏肿大，肿区触诊 疼痛，黏膜黄染。家兔球虫病的后期往往出现神经症状，四肢痉挛、麻痹，因极度衰竭而死亡。肠型 死亡快，肝型死亡较慢。 肠型球虫病见十二指肠壁厚，内腔扩张，黏膜炎症。小肠内充满气体和大量微红色黏液，肠黏膜 充血并有出血点。慢性者的肠黏膜呈灰色，有许多小而硬的白色小结节，内含有卵囊。肝球虫病症状 则为肝肿大，肝表面与实质内有白色或淡黄色的结节性病灶，取结节压碎镜检，可见到各个发育阶段 的球虫。日久的病灶，其内容物变为粉粒样钙化物。 球虫卵囊的形态特征是球虫虫种鉴定的主要依据之一。在鉴定虫种时，应着重观察外形、大小、 色泽、卵囊外膜形状，有无极粒与微
16、孔，有无卵囊残体，孢子囊大小和形状，是否有斯氏体及孢子囊 残体；子孢子的大小和形状。11 种兔球虫的形态特征以及寄生部位各不相同，例如除斯氏艾美耳球 虫寄生于胆管上皮细胞外，其他艾美耳球虫均寄生于肠上皮细胞内。 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 6 附录B （ 规范性 ） 试剂及其配制 B.1 饱和氯化钠溶液 在 1 000mL 蒸馏水的烧杯里加入 400 gNaCl，然后放在 30 恒温磁力搅拌器上搅拌至完全溶解 为止，制得饱和氯化钠溶液，常温保存备用。 B.2 2.5% 重铬酸钾溶液 2.5g重铬酸钾加入 100 mL 蒸馏水搅拌至完全溶解，常温保存备用。 B.3 0.5%S
17、DS 消化液 0.5gSDS 放入 100 mL 试剂瓶，加双蒸水定容至 100 mL，4 保存备用。 B.4 裂解液 100mmol/LNaCl，20 mmol/LEDTA，20 mmol/LTris-HCl，pH 为 7.5，4 保存备用。 B.5 20 mg/L 蛋白酶 K 溶液 将 1 g 的蛋白酶 K 粉末溶解于 5 mL 的超纯水中，待完全溶解，得到浓度为 200 mg/mL 的溶液， 10 L200mg/mL 的该溶液加入 100 mL 超纯水，得到浓度为 20 mg/L 的蛋白酶 K 溶液。 B.6 酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇溶液 按照体积 25 ： 24 ： 1 的比例配制
18、，4 保存备用。 B.7 70% 乙醇 以无水乙醇与水的体积比为 7 ：3 的比例配制，常温保存备用。 B.8 3mol/L 乙酸纳溶液 称 82 g乙酸钠溶于适量水中，加入 60 g 冰乙酸，然后转移到 1 000mL 的容量瓶中，用少量蒸馏 水洗涤烧杯 23 次，洗液并入容量瓶中，再定容到刻度线即可，常温保存备用。 B.9 电泳缓冲液的配制 取 Tris 碱 242g、冰醋酸 57.1mL、0.5 mol/LEDTA10mL、用 5 mol/L 的 HCl 调至 pH 8.0，定容 至 1 000mL，即为 50 倍 TAE 电泳浓缩缓冲液，用前采用蒸馏水 50 倍稀释即可。 B.10 生
19、理盐水 取 0.9 g 氯化钠于容器中，加蒸馏水 100 毫升，搅拌至完全溶解，于高压蒸汽灭菌锅 121 灭菌 30min，即可。 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 7 附录C （ 规范性 ） 11 种兔球虫 ITS1 PCR 扩增产物参考序列 C.1 盲肠艾美耳球虫 E. coecicola 1 AGCTTGGTGG GTTCTTATTA TTGTACTCTA TCTATCCCAC CACTACTACT ACGGTTCATC ATATTCACCT 71 CCTGCTCTCC ATTTTCCAAC TTTTGAATCT CTCTTTTCAC TTCACAACGA TTTTTTTA
20、TA GAAGAAGCCT 141 TGTTATTTGG TTTCTTTCTT CTACTTTTAT GTCTGCATTC TTTTCTTTCC AATAAATTAT TGGGATGAAA 211 TTGAGGCAGA TATGGTATGA TGATATGGAT TTGTTGAAGC AACTAG C.2小型艾美耳球虫 E.exigua 1 GAATAAGTTC TGCCTAAAGA GAGCCTTCTA ATTGGACGAA AGTTCTACAC TAGTTGGTGT GGGTCTTTTG 71 GGGCTGATTG GGGCTTTGGG GCTGGGGCTT GTTCGACGAT CACC
21、CTATCA CAATTCTCAA CTTTTGAATC 141 GTTTTTTCTT TTCTCCATCG ACGTATTTTT CTTTGATTTT AGCGATAATT TTCCTTTTTT CTCTTGGAAC 211 CGTTAAAGAT CTTTTCGCCC AAGTCAAAAT ACCAACTGGT TTTTGAGGTG GGTTGGGGAT GGTCTATATA C.3 黄艾美耳球虫 E.flavescens 1 GAATATTGTT GCAGTTTACC ACCAATGGGG TTACTTTGTC ACCTTTCTCA ACTCTAGAAT CTGTTTTTTT 71 CTT
22、TTCTCCA ACGACGCTTT TTCTTTTTCT CATTGAAGTT TTTTTTTTCC TCTTCCAACC GCATAAACTT 141 TTTTTTGTTC CATCATTCCG ATGGAATAAG GGGAAGATTA TGAAGAACGG TTGTTGAGG C.4 肠艾美耳球虫 E.intestinalis 1 TGTTTGTACC ACCGAGGGAA TAACCTTTGC ATTTTCGAAC TCTTGAATCT TTTTTTCACT CTACAACGAT 71 TTTCGAAAGT ATGCTATTTG ATCTAATTTC TCCTTCTGCA CACTT
23、TTTTT TTCCAGTAAA ATGGAATAAT 141 GGAAGTGTGG CAGGTGGATG TATTGAGAAG CGACAGACTC GCCCGGGAAT AACCAGCGTC AAAATGCTGG 211 TTTTGCTGGA TGAGGAGGGT AGCTTAATGT T C.5 无残艾美耳球虫 E.irresidua 1 TTTGGTGGGA AAAGATGATT CTACTACACT TAAAAGGCCA AAAGTTCCTT CTACTTTTGG AGCTGTGGTA 71 GGGTCGTCAG AGTACCGCCG GTGAGATCAC CTCGATATCA CT
24、TCCAACTC TTGAATCCTT TCTCCAACCT 141 CCTCAACGTG TTCTCTTTTA CTTTAATTAA TATTAAGGTA TTCATTTACC TTGATGCCAT TTTGAATGGG 211 TTAAAAATAA TGCAAA 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 8 C.6 大型艾美耳球虫 E.magna 1 TTTACTTATC ACCGGGGGTT GATCACCTAT GCATTTTGCA ACTTTTGAAT CTTTTTCTAC TCCACAACGA 71 TTTTTAGGCC CACTGCATCC TTCTTTCCCT CAGTA
25、CACAG TGGAATAGAA GTGAGGTAGC TGGGTGTGTA 141 AAAGCATCTC TTGCCCTCAA GTAACCGCCT GTTGGCGGTG AAAGGTGGGT GGCGGTAAGC TTTACCTTTC 211 TCG C.7 中型艾美耳球虫 E.media 1 GATTTTTTTC CACTGCGTCC CTGTTTTTCA GTATAGTGGG AAAGAGGTGA GGCAGTTGGG TGTGTAAAAG 71 CATCTTTCGC CCATAGGTCA CCACCACCTG TTGGTGGTGA TACTTGGGTG ATAGAAGCTT TTTT
26、TACCTT 141 TTCTGTTATG AA C.8 穿孔艾美耳球虫 E.perforans 1 TTTTATTTCA TTCCCATTTG CATCCCTTTT TTTCAGTATA TTGATTGGAA AAGAGGTGAG GCAGTTGGGT 71 GTGTGAAAGC ATCTCTCACC CAAAGGTGAC CTCCTGTCGG TGGTGACAGT TGGGTGACAG AAGCTTGACC 141 TTTTCTGTTA TGAAAAG C.9 梨型艾美耳球虫 E.piriformis 1 ACGAATACAT CCCTCTGCCT TACCCTTTAA TTGGCTGAA
27、A GCAGCTTCTA TTTTGAGGTG TGGCTTTCTG 71 GGGCCGGTTG GGGTATGGGT GGGATTGTTG CAGTGTACCA CCTCTATGGG GTTACTTTGT CACCTTTCTC 141 AACACTAGAA TCTGTTTTCT TTTTCTCTCC ATCGACGCGT TTTCTTTTTC TCAATGAAGT TTTTTTTTTT 211 CTCTTCAAAC CGCATAAACT TTTGTCTTCC ATTACTCCGA TGGAATAAGT GGAAGAATGG TTGTGCAGGG 281 GGAGACAAT C.10 斯氏艾美
28、耳球虫 E.stiedai 1 GTGGGTTTTC TGTGCCCTCC CCCACCATGG GTCGGTTCGG TCACCTCTGC ATTTTCCAAC CTTTGAATCT 71 TTTCTCACTC ACTCTACAAC GGATTTCTTG TAAGGCGGCT ATTTTTTATG TGGTCTGTCT TTCTTTCTGC 141 ATTGTTTTTG TTCCAGTAAA TTGGAACGAA AGTGAGGAGG CGGATGGACG TGCTGAATGA AGCAAAGCAG 211 CAGCCTT C.11 维氏艾美耳球虫 E.vejdovskyi 1 GTGCTG
29、CCAC AAAAGTCACC GCTGAATTTT CCAACTTTTG AATGTTTTTT CACCCTACAA CGATTTTCTA 71 AGCTCTGCTA TTTGATTGGT TTTCTGTTCT ACCTGTGTCC TCTTTTTTTT CCAGTAACTT GGAATGAAAG 141 GTGAGGCGGG CGGAATGAAT TGTAGC 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 9 附录D （ 规范性 ） 11 种兔球虫卵囊的形态特征 D.1 盲肠艾美耳球虫 E.coecicola 卵囊呈卵圆形或长柱形，较其余兔球虫种窄长。大小为（25.0 m40.0 m）（
30、15.0 m21.0 m ）， 平均为 32.4 m18.7 m。有微孔和明显的外残体。卵囊在室温下的包子化时间为 3 d。 D.2 小型艾美耳球虫 E.exigua 卵囊近似球形，囊壁无色，大小为（10.0 m25.0 m）（10.0 m25.0 m），平均为 14.1 m15.2 m。微孔不明显，无内外残体。 D.3 黄艾美耳球虫 E.flavescens 卵囊呈卵圆形，在宽端，卵囊壁趋于增厚。大小为（25.0 m37.4 m）（13.9 m23.6 m ）， 平 均为31.7 m21.4 m，微孔明显，无外残体和极粒，孢子囊具斯氏体。在27 下，孢子化的时间为38 h。 D.4 肠艾美耳
31、球虫 E.intestinalis 卵囊呈梨形，大小为（27.0 m32.0 m）（17.0 m20.0 m），平均为 29.0 m18.0 m。 有明显的微孔和孔残体。卵囊在室温下的孢子化时间为 1 d2 d。 D.5 无残艾美耳球虫 E.irresidua 卵囊呈椭圆形或卵圆形，囊壁淡黄色，大小为（35.6 m39.2 m）（24.9 m28.5 m ）， 平 均为 36.4 m 26.7 m。有微孔，无外残体。孢子囊具内残体。在恒温 26 下，孢子化的最早时间 为 50 h72 h。 D.6 大型艾美耳球虫 E.magna 卵囊较大，呈卵圆形，囊壁黄色或褐色。卵囊大小为（31.0 m40
32、.0 m）（22.0 m26.0 m ）， 平均为 35.0 m24.0 m。微孔十分明显，呈堤状突出于卵囊壁之外，这是本种卵囊最明显的特征。 有外残体，孢子囊具有斯氏体及内残体。孢子化的最早时间为 32 h，大部分为 48 h。 D.7 中型艾美耳球虫 E.media 卵囊中等大小，呈短椭圆形，囊壁微粉色或淡黄色。卵囊大小为（26.8 m32.0 m） （17.8 m21.4 m），平均为 27.8 m19.1 m。有微孔，有外残体。孢子囊具内残体。 D.8 穿孔艾美耳球虫 E.perforans 卵囊小，呈卵圆形或椭圆形，囊壁光滑，无色或微粉色。卵囊大小为（13.3 m30.0 m） （1
33、0.6 m17.3 m） ，平均为 22.7 m14.2 m。微孔不明显，有外残体。在 26 下孢子化的最早时 间为 41 h，大部分为 51 h。 D.9 梨型艾美耳球虫 E.piriformis 卵囊呈梨形，囊壁淡黄色或褐色。卵囊大小为（26.7 m35.6 m）（17.8 m21.4 m ）， 平 以正式出版文本为准 SN/T 51932020 10 均为 29.5 m19.1 m。有微孔，无外残体。孢子囊具内残体。在恒温 27 下，孢子化的最早时间 为 57 h。 D.10 斯氏艾美耳球虫 E.stiedai 卵囊较大，呈卵圆形，淡黄色，大小为（32.0 m37.4 m）（20.6 m
34、22.0 m），平均为 33.6 m21.3 m。卵囊有微孔，孢子囊具斯氏体和内残体。孢子化的最早时间为41 h，大部分为51 h。 D.11 维氏艾美耳球虫 E.vejdovskyi 卵囊近似长卵圆形，囊壁淡黄色，大小为（20.3 m35.7 m）（12.4 m27.8 m）。有微孔 和明显的内外残体。 D.12 兔艾美耳球虫典型孢子化卵囊模式图 艾美耳属球虫卵囊模式图如图 D.1 所示。 图 D.1 艾美耳属球虫卵囊模式图（仿 Levine） D.13 11 种兔艾美耳球虫典型孢子化卵囊模式图 11 种兔艾美耳球虫典型孢子化卵囊模式图如图 D.2 所示。 以正式出版文本为准 SN/T 51
35、932020 图 D.2 11 种兔艾美耳球虫典型孢子化卵囊 （ 姜英等，2 013 ） 以正式出版文本为准 附录E （ 规范性 ） 样品 DNA 的抽提 E.1 取兔球虫卵囊（或病灶组织）沉淀于离心管中，加入 400 L0.5%SDS 裂解液，加入等体 积的玻璃珠，使用匀浆器振荡 8min10 min，直到镜检无完整卵囊或病灶组织完全破碎。 E.2 将混合液转移至另一离心管中，加入 400 L 裂解液和 20 L 蛋白酶 K（20 mg/L），混匀后 55水浴 3 h，每隔 0.5 h 取出摇匀一次。 E.3 12000r/min 离心 10 min，离心结束后移出上清液至一无菌离心管中，弃
36、沉淀。向上清液 中加入等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25 ： 24 ： 1），振荡混匀后 10 000r/min 离心 10 min，吸出水 相至另一无菌离心管中。 E.4 向水相中加入 0.1 倍体积的乙酸纳溶液（3 mol/L），在漩涡混合器上混匀后加入 2.5 倍体积 （加入盐之后计算的体积）预冷的无水乙醇，充分混匀后，-20 放置 1 h。 E.5 12000r/min 离心 10 min，吸弃上清液。 E.6 用 500 L70% 乙醇重新洗涤沉淀 1 次。 E.7 12000r/min离心 10 min 后，吸弃上清液，晾干后，用 20 L 双蒸水溶解沉淀，-20 保存 备用。如长时间保存，也可放置于 -80 。 样品 DNA 提取也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按照说明书进行操作。 SN/T 5193 2020 书号：155175130 定价： 18.00元
