1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 51682019 出口动物源食品中羟甲烯龙的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 Determination of oxymetholone in animal-origin foodstuffs for export LC-MS / MS method 2019-10-25 发布 2020-05-01 实施 中华人民共和国海关总署 发 布 ICS 67.050 C 53 I SN / T 51682019 前 言 本标准按照 GB / T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和
2、国武汉海关、武汉食品化妆品检验所、中华人民共和国南京 海关。 本标准主要起草人：王鹏、杨永、赵晓亚、王晗、丁涛、王振华、叶诚、罗静。 1 SN / T 51682019 出口动物源食品中羟甲烯龙的测定 液相色谱 - 质谱 / 质谱法 1 范围 本标准规定了出口动物源食品中羟甲烯龙残留量的液相色谱 - 质谱 / 质谱的测定方法。 本标准适用于猪肉、牛肉、羊肉、牛奶和鸡蛋中羟甲烯龙残留量的测定，其他食品也可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 G
3、B / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样经均质酶解、乙醚提取、液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定，外标法定量。 4 试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为 GB / T 6682 规定的一级水。 4.1 甲酸（HCOOH，CAS 号：64-18-6） 。 4.2 甲醇（CH 3 OH，CAS 号：67-56-1）：色谱纯。 4.3 乙醚（C 2 H 5 OH 5 C 2 ，CAS 号：60-29-7）。 4.4 乙酸（CH 3 COOH，CAS 号：64-19-7）。 4.5 三水合乙酸钠（CH 3 COONa3H 2 O，CAS 号：6131-90-
4、4）。 4.6 碳酸钠（Na 2 CO 3 ，CAS 号：497-19-8）。 4.7 氯化钠（NaCl，CAS 号：7647-14-5） 。 4.8 无水硫酸镁（MgSO 4 ，CAS 号：7487-88-9）。 4.9 - 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶溶液（ -Glucuronidase / aryl sulfatase）： - 葡萄糖醛酸酶活力 100 000 units / mL，芳基硫酸酯酶活力 20 000 units / mL。 4.10 羟甲烯龙标准物质（oxymetholone， C 21 H 32 O 3 ，CAS 号：434-07-1）：纯度大于等于 98%。 4.11
5、 0.2 mol / L乙酸钠溶液：称取13.6 g三水合乙酸钠（4.5），溶解于500 mL水中，用适量乙酸（4.4） 调节 pH 至 5.2。 4.12 饱和碳酸钠溶液：称取约 40 g 碳酸钠（4.6），溶解于 100 mL 水中，得到饱和碳酸钠溶液。 4.13 0.1% 甲酸甲醇溶液：移取 1.0 mL 甲酸（4.1），用甲醇（4.2）定容至 1 000 mL，混匀。 4.14 0.1% 甲酸水溶液：移取 1.0 mL 甲酸（4.1），用水定容至 1 000 mL，混匀。 4.15 0.1% 甲酸甲醇 -0.1% 甲酸水溶液（30 : 70， v / v）：量取 30 mL 0.1%
6、甲酸甲醇溶液（4.13）和 70 mL 0.1% 甲酸水溶液（4.14），混匀。 4.16 羟甲烯龙标准储备液：称取羟甲烯龙标准物质（精确至 0.000 1 g）（4.10），用甲醇（4.2）溶解， 2 SN / T 51682019 配制成浓度为 1.0 mg / mL 的标准储备液，-18 以下避光保存，有效期 3 个月。 4.17 羟甲烯龙标准中间液：准确移取 1.0 mL 羟甲烯龙标准储备液（4.16）于 100 mL 容量瓶中，用 甲醇（4.2）定容至刻度，配制成浓度为 10 g / mL 的标准中间溶液，于 -18 冰箱内储存。 4.18 基质标准工作液：在对应基质空白样品中添加羟
7、甲烯龙标准中间液（4 .17）25 L、50 L、100 L、 250 L、500 L，按照本标准进行前处理，得到基质标准工作液供液相色谱 - 质谱 / 质谱仪测定。 4.19 微孔滤膜：有机系，0.22 m。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱 - 质谱 / 质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2 组织捣碎机。 5.3 振荡器。 5.4 涡旋混合器。 5.5 分析天平：精确至 0.000 1 g 和 0.01 g。 5.6 离心机：转速不低于 4 000 r / min。 5.7 氮气吹干仪。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 6.1.1 猪肉、牛肉、羊肉 猪肉 、牛肉、羊肉，各约
8、500 g 放入组织捣碎机均质，充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容 器内，并标明标记。 6.1.2 鸡蛋 取 1 6 枚新鲜鸡蛋（约 1 kg），洗净、去壳后充分混匀，均分成 2 份，分别装入清洁容器内，并 标明标记。 6.1.3 牛奶 将牛奶从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用。 制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2 试样保存 猪肉、牛肉、羊肉、鸡蛋试样于 -20 以下保存，牛奶试样置于 0 4 条件下保存。 7 测定步骤 7.1 提取 称取 约 5g 试样（精确至 0.01g）置于 50 mL 离心管中，准确加入 10mL 乙酸钠溶液（4.11），加 入
9、 25 L- 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶溶液（4.9），涡旋混匀，37 水浴 2 h。向离心管中加入约 1.5 mL 饱和碳酸钠溶液（4.12）使混合溶液 pH 为 10，加入 20 mL 乙醚（4.3）、5 g 氯化钠（4.7）和 2 g 无水硫酸镁（4.8），剧烈摇晃后涡旋混匀 1 min，振荡提取 30 min，以 4 000 r / min 的转速离心 5 min， 3 SN / T 51682019 冷冻至水相结冰，取上层乙醚于50 mL离心管中，用氮气吹至近干，准确加入1.0 mL 0.1%甲酸甲 醇 -0.1% 甲酸水溶液（30 : 70， v / v）（4.15）溶解残渣，
10、过 0.22 m 微孔滤膜（4.19），供液相色谱 - 质 谱 / 质谱仪测定。 注：由于在提取过程中使用的乙醚为极易挥发并具有麻醉作用的有机溶剂，溶剂提取过程宜在通风橱内完成。 7.2 测定 7.2.1 液相色谱条件 7.2.1.1 色谱柱：C 18 色谱柱，100 mm3.0 mm（内径），粒径 3.5 m 或性能相当者。 7.2.1.2 柱温：30 。 7.2.1.3 流动相：A 为 0.1% 甲酸水溶液，B 为 0.1% 甲酸甲醇溶液，梯度洗脱，洗脱程序见表 1。 表 1 液相色谱的梯度洗脱程序 时间 / min 流动相 A / % 流动相 B / % 0.00 70 30 1.00
11、70 30 2.00 30 70 3.00 30 70 4.00 5 95 8.00 5 95 8.10 70 30 10.00 70 30 7.2.1.4 流速：0.4 mL / min ； 7.2.1.5 进样量：5 L。 7.2.2 质谱条件 7.2.2.1 离子源：电喷雾离子源（ESI）。 7.2.2.2 扫描方式：正离子扫描。 7.2.2.3 检测方式：多反应监测模式（MRM）。 7.2.2.4 监测离子对、定量离子对见表 2。 表 2 羟甲烯龙的监测离子对、定量离子对 被测物 监测离子对（m / z） 定量离子对（m / z） 羟甲烯龙 333.0 / 99.0 333.0 / 1
12、59.2 333.0 / 99.0 7.2.2.5 雾化气、气帘气 、辅助气、碰撞气均为高纯氮气及其他适合气体，使用前应调节各气体流 量以使质谱灵敏度达到检测要求，喷雾电压、去簇电压、碰撞气能量等参数值应优化至最佳灵敏度， 其他参考质谱参数参见附录 A。 4 SN / T 51682019 7.2.3 液相色谱 - 质谱 / 质谱测定 7.2.3.1 定性测定 按照液相色谱 - 质谱 / 质谱条件测定试样和基质标准工作液，试样中目标化合物的保留时间与基 质标准工作液中对应化合物的保留时间偏差在 2.5% 之内；定性离子对的相对丰度与浓度相当的基 质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表
13、 3 的规定，且每个离子的信噪比均 3，则可 判断试样中存在相应的被测物。 表 3 定性离子对相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 / % 50 2050（含） 10 20（含） 10 允许的相对偏差 / % 20 25 30 50 7.2.3.2 定量测定 将基质标准工作液和试样溶液依次注入液相色谱 - 质谱 / 质谱仪中，测得定量离子峰面积。基质 标准工作液和待测样液中，羟甲烯龙的响应值均应在仪器检测的定量线性范围内。在上述仪器条件下， 羟甲烯龙的提取离子色谱图参见附录 B。 7.3 空白试验 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。 8 结果计算和表述 采用基质匹配标准工作曲线定量，试
14、样中羟甲烯龙的含量由液相色谱 - 质谱 / 质谱仪的数据处理 软件或按式（1）计算，计算结果应扣除空白值。 （ 1） 式中： X试样中被测组分含量，单位为微克每千克（ g / kg）； c 从基质标准工作曲线得到的样液中被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng / mL）； V试样定容体积，单位为毫升（mL）； m试样质量，单位为克（g）； f 富集因子。 注：结果保留 3 位有效数字。 9 检出限、定量限和回收率 9.1 检出限和定量限 猪肉、牛肉、羊肉、牛奶和鸡蛋中羟甲烯龙的检出限为 20.0 g / kg，定量限为 50.0 g / kg。 9.2 回收率 猪肉、牛肉、羊肉、牛奶和鸡蛋中
15、羟甲烯龙的添加水平和回收率数据参见附录 C。 5 SN / T 51682019 附 录 A （资料性附录） a 质谱参考参数 1） A.1 电喷雾电压（IS）：5 500 V。 A.2 离子源温度（TEM）：500 。 A.3 气帘气压力（CUR，kPa）：241 （氮气）。 A.4 雾化气压力（GS1，kPa）：413 （氮气）。 A.5 辅助气压力（GS2，kPa）：344 （氮气）。 A.6 碰撞气电压（CE）、去簇电压（DP）见表 A.1。 表 A.1 羟甲烯龙的主要参考质谱参数 名称 母离子（m / z） 子离子（m / z） 扫描模式 去簇电压（DP） / V 碰撞气电压（CE）
16、 / eV 羟甲烯龙 333.0 99.0 * ESI + 140 40 159.2 ESI + 30 注：* 表示定量离子对。 1）非商业性声明：本标准中所列参数是在 AB SCIEX 6500 质谱仪完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提 供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号仪器。 6 SN / T 51682019 附 录 B （资料性附录） 标准物质的提取离子色谱图 图 B.1 羟甲烯龙标准溶液的提取离子色谱图（50.0 ng / mL） a） b） 7 SN / T 51682019 附 录 C （资料性附录） 添加水平及回收率数据 表 C.1 羟甲烯龙在典型
17、基质中的添加水平及其回收率 化合物 样品基质 添加浓度 / （ g / kg） 回收率 / % 相对标准偏差 / % 羟甲烯龙 猪肉 50.0 85.4109 10.2 1.0010 2 89.7109 10.9 5.0010 2 86.7110 7.4 牛肉 50.0 89.5104 6.6 1.0010 2 81.4106 12.3 5.0010 2 81.3108 11.3 羊肉 50.0 86.1106 12.2 1.0010 2 85.5109 9.4 5.0010 2 83.3104 11.3 牛奶 50.0 83.1107 10.1 1.0010 2 83.3110 9.8 5.
18、0010 2 82.2110 11.1 鸡蛋 50.0 80.0105 14.3 1.0010 2 86.8108 8.6 5.0010 2 81.3110 12.0 9 SN / T 51682019 Foreword This standard was drafted according to GB / T 1.12009. This standard was proposed by and under the charge of General Administration of Customs, P. R. China. This standard was drafted by Wuh
19、an Customs District P. R. China, Wuhan Institute for Food and Cosmetic Control, Nanjing Customs District P. R. China. This standard was mainly drafted by Wang Peng,Yang Yong, Zhao Xiaoya,Wang Han, Ding Tao, Wang Zhenhua, Ye Cheng, Luo Jing. 11 SN / T 51682019 Determination of oxymetholone in animal-
20、origin foodstuffs for exportLC-MS / MS method 1 Scope This standard specifies the method of determination of oxymetholone in animal-origin foodstuffs for export LC-MS / MS. This standard is applicable to the determination of oxymetholone residues in pork, beef, mutton, milk and eggs for export. Othe
21、r foods may be also tested by consulting this standard. 2 Normative references The following documents are necessary for this standard. For dated reference， only dated editions shall apply to this standard. For undated reference， the latest edition of the normative document （including subsequent ame
22、ndments） referred to applies. GB / T 6682 Water for analytical laboratory useSpecification and test methods 3 Principle The contents of oxymetholone in the test sample are extracted by diethyl ether after enzymolysis, the contents are determined by LC-MS / MS, quantified by external standard method.
23、 4 Reagents and materials Unless otherwise specified, all reagents used should be of analytically pure， “water” is the first grade water prescribed by GB / T 6682. 4.1 Formic acid（HCOOH, CAS No. : 64-18-6）. 4.2 Methanol（CH 3 OH, CAS No. : 67-56-1）: HPLC grade. 4.3 Diethyl ether（C 2 H 5 OH 5 C 2 , CA
24、S No. : 60-29-7）. 4.4 Acetic acid（CH 3 COOH, CAS No. : 64-19-7）. 4.5 Sodium acetate trihydrate（CH 3 COONa3H 2 O, CAS No. : 6131-90-4）. 4.6 Sodium carbonate（Na 2 CO 3 , CAS No. : 497-19-8）. 4.7 Sodium chloride（NaCl, CAS No. : 7647-14-5）. 4.8 Magnesium sulfate anhydrous（MgSO 4 , CAS No. : 7487-88-9）.
25、4.9 -Glucuronidase / aryl sulfatase: activity of -Glucuronidase 100 000 units / mL, activity of aryl sulfatase 20 000 units / mL. 4.10 Standard substance of oxymetholone（C 21 H 32 O 3 , CAS No. : 434-07-1）： purity 98 %. 4.11 0.2 mol / L sodium acetate solution: weigh 13.6 g sodium acetate trihydrate
26、（4.5）and dissolve in 500 mL water, add appropriate acetic acid（4.4）to adjust the pH to 5.2. 12 SN / T 51682019 4.12 Saturated solution of sodium carbonate: weigh about 40 g sodium carbonate（4.6） and dissolve in 100 mL water. 4.13 0.1% Methanol-formic acid solution: pipette 1.0 mL formic acid（4.1）and
27、 dilute to 1 000 mL with methanol（4.2）. 4.14 0.1% Formic acid solution: pipette 1.0 mL formic acid（4.1）and dilute to 1 000 mL water. 4.15 0.1% Methanol-formic acid solution-0.1% formic acid solution （30 : 70， v / v）: mix 30 mL of methanol-formic acid solution（4.13） with 70 mL of formic acid solution
28、（4.14）. 4.16 Standard stock solution of oxymetholone: weigh appropriate standard substance of oxymetholone（4.10） accurately and dissolve with methanol（4.2） . The concentration of the solution is 1.0 mg / mL. The stock solution should be stored at -18 refrigerator in dark. 4.17 Intermediate solution
29、of oxymetholone: volume 1.0 mL of standard stock solution of oxymetholone（4.16） and dilute to 100 mL with methanol（4.2） . The concentration of the solution is 10 g / mL. The intermediate solution should be stored at -18 refrigerator in dark. 4.18 Matrix matched working solution: 25 L， 50 L, 100 L, 2
30、50 L and 500 L intermediate solution of oxymetholone（4.17）is accurately pipetted into matrix matched blank samples, the samples are subjected to the same operation described as follow to obtain the matrix matched working solution. 4.19 Membrane: organic, 0.22 m. 5 Apparatus and equipment 5.1 High pe
31、rformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: equipped with electrospray ionization source （ESI）. 5.2 Tissue blender. 5.3 Oscillator. 5.4 Vortex mixer. 5.5 Analytical balance: accurate to 0.000 1 g and 0.01g. 5.6 Centrifuge: higher than 4 000 r / min. 5.7 Nitrogen evaporator. 6 Sample pr
32、eparation and storage 6.1 Preparation of test sample 6.1.1 Pork, beef and mutton Take approximately 500 g of representative sample of pork, beef or mutton in a tissue blender, mix thoroughly, divide into two portions and placed into a clean container, sealed and labeled. 6.1.2 Eggs Take the edible p
33、art for 16 eggs（approximately 1 000 g） blended in a tissue blender, mix thoroughly, divide into two portions and placed into a clean container, sealed and labeled. 6.1.3 Milk Warm the milk sample to room temperature, mix thoroughly. In the course of sampling and sample preparation, precautions must
34、be taken to avoid the contamination or any factors which may cause the change of residue content. 13 SN / T 51682019 6.2 Storage of test sample The sample of pork, beef, mutton and eggs should be stored below -20 . The sample of milk should be stored at 0 4 . 7 Procedure 7.1 Extraction Weigh 5 g（acc
35、urate to 0.01 g）of the test sample into a 50 mL centrifuge tube, add 10mL 0.2 mol / L sodium acetate solution（4.11）and 25 L -Glucuronidase / aryl sulfatase（4.9）, mix intensely and stay in 37 for 2 h. Then almost 1.5 mL saturated solution of sodium carbonate（4.12） is added to adjust the pH to 10, and
36、 20 mL diethyl ether（4.3）, 5 g sodium chloride（4.7）, 2 g magnesium sulfate anhydrous（4.8） added, mix intensely and extract with vibrating for 30 min. Then centrifuge for 5 min at 4 000 r / min. Freeze the sample till the aqueous phase is frozen. Take the supernatant into a 50 ml centrifuge tube, blo
37、w to dryness by a nitrogen evaporator. Dissolve the residue with 1.0 mL 0.1% methanol - 0.1% formic acid solution- formic acid solution （30 ： 70， v / v）（4.15）, after being filtrated with a 0.22 m membrane（4.19） , the solution is ready for analysis by LC-MS / MS. 7.2 Determination 7.2.1 LC operating
38、conditions 7.2.1.1 LC column: C 18 LC column（100 mm 3.0 mm i.d.）；3.5 m or equivalent. 7.2.1.2 Column temperature: 30 . 7.2.1.3 Mobile phase: A is 0.1% formic acid solution, B is 0.1% methanol - formic acid solution, the grade of mobile phase is listed in table 1. Table 1 The grade of mobile phase Ti
39、me / min Mobile phase A / % Mobile phase B / % 0.00 70 30 1.00 70 30 2.00 30 70 3.00 30 70 4.00 5 95 8.00 5 95 8.10 70 30 10.00 70 30 7.2.1.4 Flow rate: 0.4 mL / min. 7.2.1.5 Injection volume: 5 L. 14 SN / T 51682019 7.2.2 MS / MS operating conditions 7.2.2.1 Ion source: electrospray ionization sour
40、ce （ESI）. 7.2.2.2 Scanning model: positive ion. 7.2.2.3 Monitoring model: multiple reaction monitor（MRM）. 7.2.2.4 Monitoring ions are listed in table 2. Table 2 Monitoring ions Analyte Monitoring ions pairs（m / z） Quantitative ions pairs（m / z） Oxymetholone 333.0 / 99.0 333.0 / 159.2 333.0 / 99.0 7.
41、2.2.5 Nebulizer gas, curtain gas and auxiliary gas are high purity nitrogen or other suitable gases. They are optimized by adjusting the gas flow parameters. Ion spray voltage, deflector voltage, collision energy and so on should be optimized to reach the highest sensitive of mass spectrometer, refe
42、renced conditions are listed in annex A. 7.2.3 LC-MS / MS determination 7.2.3.1 Confirmation Under the LC-MS / MS operating conditions, the standard working solution and sample solution is injected. If the retention times of sample are consistent with that of standard solution with the difference le
43、ss than 2.5%. The relative intensities of sample transitions shall correspond to those of standard solution transitions for confirmation. The concentration of standard solution should be the same with those of sample solution. The signal-to-noise ratio of monitoring ions of sample should be higher t
44、han 3. The permitted tolerances listed in table 3, then the corresponding analyte must be present in sample. Table 3 Maximum permitted tolerances relative ion intensities while confirmation Relative intensity / % 50 2050（inclusive） 1020（inclusive） 10 Permitted tolerances / % 20 25 30 50 7.2.3.2 Quan
45、titation determination Matrix matched standard working solution and sample solution are injected into LC-MS/MS to obtain the peak area of quantitative ion. The responses of analyte in the matrix matched standard working solution and the sample solution should be within the linear range of the instru
46、ment detection. See reconstituted （MRM） chromatograms of oxymetholone in annex B. 7.3 Blank test The operation of the blank test is the same as that described in the method of determination, but with the omission of sample addition. 8 Calculation and expression of the result Calculate the content of
47、 oxymetholone in the test sample by LC-MS / MS data processor or according to the 15 SN / T 51682019 followed formula （1）. The blank values should be deducted from the calculation results. （ 1） Where Xthe content of oxymetholone in the test sample， g / kg . c the concentration of oxymetholone obtain
48、ed from the standard working solution, ng / mL. Vthe constant volume of the test sample, mL. mthe mass of the test sample, g. f enrichment factor. Note ：Three significant figures should be retained. 9 Limit of detection, quantification and recovery 9.1 Limit of detection and quantification In pork,
49、beef, mutton, milk and eggs, the limit of detection（LOD）for oxymetholone is 20.0 g / kg and the limit of quantification （LOQ） is 50.0 g / kg. 9.2 Recovery The fortifying concentration of oxymetholone and the range of recovery are showed in annex C. 16 SN / T 51682019 Annex A （Informative） a MS / MS condition 1） A.1 IS: 5 500 V. A.2 TEM: 500 . A.3 CUR （kPa） ： 241 （N 2 ） . A.4 GS1 （kPa） ： 413 （N 2 ） . A.5 GS2 （kPa） ： 344 （N 2 ） . A.6 CE and DP are listed in table A.1. 1）The parameters listed in this standard are completed in the AB SCIEX 6500 mass spectrommeter. This info
