1、ICS 65.020.20 CCS B 05 DB5117 四川省（达州市）地方标准 DB5117/T 30 2020 达州黄花组织培养繁育技术规程 Technical Regulation Of Tissue Culture And Propagation For HemerocalliscitrinaBaroniOf DaZhou 2020-12-17发布 2020-12-17实施 达州市市场监督管理局 发布 DB5117/T 30-2020 前 言 本文件 按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉
2、及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件 由 达州市 农业 农村局 提出并归口。 本文件 起草单位： 达州市 农业科学研究院 。 本文件 主要起草人： 李益、胡振兴、杨小丽、高龙梅、吴明阳、张玲、刘小英、贾荟芹、李薇、邓 力、杨峰。 DB5117/T 30-2020 引 言 本文件第 4.2.2章节 MS培养基配制 ， 由于 日常购买 的白砂糖和琼脂质量 存在 差异，在 规定浓度 范 围内 自行 选择用量 不影响 最终结果。 本文件第 4.3章节 不同 培养阶段培养基 配制，在 愈伤诱导 培养基 、 继代培养基、分化培养基和生 根培养基 中 加入 70mg/L的 抗菌剂 ， 可
3、减少 杂菌污染 的情况 。 生根 培养基 中加入 2g/L的 活性炭 ， 可 减少 培 养过程中褐化的现象。 本文件第 4.10.2章节 继代 培养， 需控制 愈伤组织 大小 ，将直径大于 2cm的愈伤组织切 成直径 2cm 大小 进行 继代增殖 。 本文件第 5章节 炼苗 ， 营养钵 中基质成分及比例为 泥炭土 ： 珍珠岩 ： 蛭石 =1:1:1。 DB5117/T 30-2020 达州黄花组织培养繁育技术规程 1 范围 本文件规定了黄花组织培养繁育技术规程的术语和定义、 组织培养繁育技术流程 、 炼苗的要求。 本文件适用于达州 市行政区域 内黄花 的 组织培养育苗。 2 规范性引用文件 下
4、列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882界定的以及 下列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 组织培养 tissue culture 在无菌培养基上，对植物离体器官、组织或细胞进行培养，以形成再生植株，或培养新的育种材 料的生物技术。 3.2 外植体 explan
5、t 生长在培养基上的被培养的器官、组织或细胞。 3.3 培养基 culture medium 为外植体的生长、发育提供所需物质的基质。 3.4 组培苗 tissue culture seedling 利用 外植体 ，在无菌和适宜的人工条件下，采用植物组织培养技术，培育出的完整植株。 3.5 接种 inoculation 将外植体经消毒后，在无菌条件下植入培养基上的过程。 DB5117/T 30-2020 3.6 褐化 browning 在植物组织培养中，外植体由于自身分泌的酚类化合物被氧化产生褐色醌类物质，导致外植体褐 变的现象。 4 黄花组织培养繁育技术流程 4.1 实验室要求 黄花组织培养
6、实验室应包括：药品室、洗涤室、准备室、缓冲室、接种室、培养室，配备完善的水、 电供应系统和空气、灯光、温度、湿度调节系统。 4.2 培养基配制 4.2.1 母液配制 按 GB/T 603、 GB/T 6682的 规定 执行 。 将培养基所需的大量元素、铁盐、有机成分配制成比使用浓 度高 100倍的母液，微量元素配制成比使用浓度高 1000倍的母液，均用棕色玻璃瓶 保存，贴上标签，注 明母液号、配制倍数、日期，保存在冰箱冷藏室中 。 4.2.2 MS培养基配制 按 GB/T 603、 GB/T 6682的 规定 执行 。 配制 MS培养基时将四种母液按比例混合后，加入白砂糖、琼 脂和水。所需白砂
7、糖浓度为 20g/L 30g/L，琼脂粉浓度为 4g/L 6g/L。 4.3 不同培养阶段培养基配制 4.3.1 愈伤诱导培养基 MS + BA 3.0mg/L + NAA 0.1mg/L 4.3.2 继代培养基 MS + BA 2.0mg/L + NAA 0.1mg/L 4.3.3 分化培养基 MS + BA 1.0mg/L + NAA 0.1mg/L 4.3.4 生根培养基 MS + NAA 0.1mg/L 4.4 培养基 pH调节 黄花培养基最佳 pH值为 5.73 5.75。用酸度计测定 pH，并用 1mol/LKOH或 1mol/L HCl调节。 4.5 培养基分装和灭菌 4.5.1
8、 培养基分装 配制好的培养基趁热分装，培养基厚度 1.5cm 2.5cm。分装后立即加盖或用封口膜封严，不同的处 理做好标记。 DB5117/T 30-2020 4.5.2 培养基灭菌 分装后的培养基进行高压灭菌处理，在 0.8kPa 1.1kPa、 121状态下保持 20min。灭菌完毕后放入 接种室冷却待用。 4.6 培养室消毒 将培养室清扫干净，关闭门窗，按每立方米空间用高锰酸钾 16g，福尔马林 32ml，水 16ml，放在瓷 瓦器皿中混合产生蒸气进行消毒，消毒时间 10 12h。每隔 15 20d消毒一次。 4.7 材料选取 选择春苗生长期健壮无病斑的黄花幼苗整株，切除根、叶部分，保
9、留约 8cm 10cm茎基段，用软毛 刷刷掉泥土后再用水冲洗 30min。 4.8 材料消毒 在无菌操作台上先用 75%酒精浸泡 30s，无菌水冲洗 3次。再用 0.1%次氯酸钠浸泡 5 8min, 用无菌水 冲洗 3次，冲洗过程中不断摇晃放置材料的容器，去除消毒液残留。 4.9 剥离外植体和接种 在超净工作台上铺上无菌滤纸，用无菌镊子将茎基段剥开直至露出茎尖生长点，在 20X的显微镜下 用无菌解剖针切取 0.5mm茎尖 1 2个，随即接种于黄花愈伤诱导培养基上，切口与培养基表面接触。每 剥一个茎段换一张无菌滤纸。 4.10 组培苗培养 4.10.1 愈伤诱导培养 将接种外植体的愈伤诱导培养基
10、放置在培养架上进行愈伤诱导培养。温度 22 25，光照强度 800lx，光照时间 10h/d。 4.10.2 继代培养 长出愈伤组织后，转接于继代培养基上进行增殖培养，每 2-3周继代一次。温度 22 25，光照 强度 1500lx 2000lx，光照时间 10h/d。 4.10.3 分化培养 选择致密型愈伤组织转接于分化培养基上进行不定芽的分化培养。温度 22 25，光照强度 1500lx 2000lx，光照时间 10h/d。 4.10.4 生根培养 将分化出不定芽丛的愈伤组织转接于生根培养基中进行生根培养，每瓶放 3 5 株。温度 22 25， 光照强度 2000lx 2500lx，光照时间 12h/d。 5 炼苗 当组培苗长出 3 4条幼根，根系长度达到 5cm 6cm时可开始炼苗。将培养瓶转移到大棚苗床上开盖 放置 3 5d，用镊子取出小苗，洗去根部培养基，移栽到装有基质的营养钵中生长 30 45d，炼苗时大棚 温度控制在 15 25，湿度保持在 45% 60%。 DB5117/T 30-2020 _
