1、ICS 65.150B 50 DB3301浙 江 省 杭 州 市 地 方 标 准DB 3301/T 1096 2018南 美 白 对 虾 肝 肠 胞 虫 聚 合 酶 链 式 反 应 检 测方 法 2018 -09- 05发 布 2018- 10-05实 施杭 州 市 质 量 技 术 监 督 局 发 布 前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1-2009给 出 的 规 则 起 草 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任 。本 标 准 由 杭 州 市 农 业 局 提 出 并 归 口
2、。本 标 准 起 草 单 位 ： 杭 州 市 水 产 技 术 推 广 总 站 、 杭 州 萧 山 农 技 推 广 中 心 水 产 站 、 杭 州 大 洋 庄园 农 业 发 展 有 限 公 司 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 叶 键 、 施 礼 科 、 许 婷 、 王 力 、 徐 铃 威 、 陈 凡 、 蒋 静 、 韩 钶 、 王 国 成 。 DB3301/T 10962018 1 南 美 白 对 虾 肝 肠 胞 虫 聚 合 酶 链 式 反 应 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 南 美 白 对 虾 肝 肠 胞 虫 （ Enterocytozoon hepatopenaei，
3、EHP） 聚 合 酶 链 式 反 应 （ PCR）检 测 的 材 料 、 仪 器 和 设 备 、 操 作 步 骤 和 结 果 判 定 。本 标 准 适 用 于 南 美 白 对 虾 肝 肠 胞 虫 的 定 性 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 GB/T 6682 分 析 实 验 室
4、 用 水 规 格 和 试 验 方 法SC/T 7103 水 生 动 物 产 地 检 疫 采 样 技 术 规 范3 检 测 材 料3.1 水符 合 GB/T 6682中 一 级 水 的 要 求 。3.2 Taq酶-20 保 存 ， 避 免 反 复 冻 融 。3.3 dNTPs 含 dCTP、 dGTP、 dATP、 dTTP各 10 mmol/L， -20 保 存 。3.4 引 物有 两 对 引 物 ， 浓 度 均 为 25 mol/L， 其 序 列 分 别 为 ：F1： 5-CAG CAG GCG CGA AAA TTG TCC A-3R1： 5-AAG AGA TAT TGT ATT GCG
5、 CTT GCT G-3， 扩 增 778 bp的 片 段 ；F2： 5-CAA CGC GGG AAA ACT TAC CA-3R2： 5-ACC TGT TAT TGC CTT CTC CCT CC-3， 扩 增 上 述 片 段 中 的 176 bp片 段 。3.5 DNA分 子 量 标 准推 荐 使 用 DNA ladder 100， 各 片 段 大 小 依 次 为 ： 1500 bp， 1000 bp， 900 bp， 700 bp， 600 bp， 500bp， 400 bp， 300 bp， 200 bp， 100 bp。 3.6 无 水 乙 醇分 析 纯 ， 使 用 前 -20
6、预 冷 。 DB3301/T 10962018 2 3.7 矿 物 油无 DNA酶 和 RNA酶 。4 仪 器 和 设 备4.1 PCR扩 增 仪4.2 电 泳 仪输 出 直 流 电 压 0 V 600 V。4.3 水 平 电 泳 槽50 mL 500 mL， 带 有 凝 胶 船 及 样 孔 梳 。 4.4 移 液 器量 程 0.5 L 10 L、 10 L 100 L、 100 L 1000 L移 液 器 各 1支 及 适 配 吸 头 ， 0.5 L 10 L移 液 器 建 议 使 用 带 滤 芯 吸 头 。4.5 紫 外 透 射 仪 或 凝 胶 成 像 仪可 遮 挡 可 见 光 干 扰 ，
7、 在 230 nm 300 nm波 长 对 凝 胶 发 射 紫 外 线 ， 推 荐 带 照 相 功 能 。4.6 恒 温 培 养 箱4.7 冰 箱具 冷 藏 箱 ， 并 带 -20 以 下 冷 冻 箱 体 。4.8 离 心 机 转 速 可 达 15000 r/min以 上 。5 操 作 步 骤5.1 采 样将 待 检 虾 置 于 采 样 容 器 内 ， 加 10倍 体 积 以 上 的 95%乙 醇 ， 没 过 待 检 样 ， 常 温 保 存 ， 可 保 存 30d。 采样 数 量 应 符 合 SC/T 7103水 生 动 物 产 地 检 疫 采 样 技 术 规 范 的 要 求 。5.2 样 品
8、 处 理将 待 检 虾 置 于 灭 菌 滤 纸 上 ， 滤 干 乙 醇 。 幼 体 、 仔 虾 及 小 于 2 cm的 幼 虾 取 完 整 个 体 。 大 于 2 cm的 幼 虾 、亚 成 年 虾 及 成 虾 取 肝 胰 腺 组 织 。 充 分 研 磨 混 匀 后 取 10 mg 50 mg的 样 品 ， 置 于 1.5 mL的 离 心 管 中 ， 立 即进 行 DNA抽 提 。 5.3 DNA抽 提加 150 L CTAB溶 液 (见 附 录 A.1)， 研 磨 成 糊 状 后 再 加 CTAB溶 液 至 900 L。 混 匀 后 于 25 作 用 2 h。加 600 L抽 提 液 1(见
9、附 录 A.2)， 充 分 混 合 30 s； 12000 r/min离 心 5 min， 取 上 层 水 相 ； 加 700 L抽 提 DB3301/T 10962018 3 液 2(见 附 录 A.3)， 充 分 混 合 30 s； 12000 r/min离 心 5 min， 取 上 层 水 相 ； 加 入 1.5倍 体 积 -20 预 冷 的 无水 乙 醇 ， 混 匀 后 于 -20 放 置 30 min以 上 ； 15000 r/min离 心 30min， 弃 上 清 ， 37 干 燥 5 min； 最 后 加20 L双 蒸 水 溶 解 ， 作 为 PCR模 板 。可 以 采 用 同
10、等 抽 提 效 果 的 商 品 化 DNA抽 提 试 剂 盒 。5.4 设 立 对 照经 序 列 测 定 确 认 为 阳 性 和 阴 性 的 对 虾 组 织 ， 按 5.3提 取 获 得 DNA， 分 别 作 为 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照 ；并 以 双 蒸 水 作 为 空 白 对 照 。5.5 第 一 步 PCR扩 增5.5.1 在 0.2 mLPCR 管 中 加 入 10PCR缓 冲 液 (见 附 录 A.4)5 mL、 25 mmol/L氯 化 镁 5 mL、 dNTP 1 mL、引 物 F1 和 R1 各 1 mL、 Taq酶 5 U、 待 测 样 品 DNA 2 mL， 最
11、后 加 双 蒸 水 至 50 mL。 使 用 不 具 热 盖 功 能 的PCR仪 时 ， 在 反 应 混 合 物 上 覆 加 25 mL矿 物 油 。 5.5.2 低 速 离 心 后 将 PCR管 置 于 PCR 仪 中 ， 按 以 下 程 序 进 行 扩 增 ： 94 变 性 3 min； 94 20 s， 5820 s， 72 45 s， 35个 循 环 ； 72 5 min； 4 保 温 。5.6 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳用 1 TAE电 泳 缓 冲 液 (见 附 录 A.5)配 置 1.5%且 含 0.5 g/mL EB(见 附 录 A.6)的 琼 脂 糖 凝 胶 平 板 。 将该
12、凝 胶 平 板 放 入 水 平 电 泳 槽 ， 加 样 孔 朝 负 极 ， 加 入 1 TAE电 泳 缓 冲 液 至 没 过 胶 面 1 mm 2 mm。 将 6LPCR扩 增 产 物 和 2 L样 品 缓 冲 液 (见 附 录 A.7)混 匀 后 加 入 加 样 孔 。 5 V/cm电 泳 约 30 min， 当 溴 酚 蓝 迁移 至 琼 脂 糖 凝 胶 的 1/2 2/3处 时 停 止 电 泳 ， 将 凝 胶 置 于 紫 外 灯 下 观 察 并 判 断 结 果 。5.7 第 二 步 PCR反 应5.7.1 第 一 步 PCR 扩 增 后 的 产 物 经 电 泳 未 见 目 的 条 带 ，
13、取 2mL 产 物 作 为 模 板 ； 见 到 目 的 条 带 的 ， 可 不作 第 二 步 PCR 扩 增 。5.7.2 在 0.2 mLPCR 管 中 加 入 10PCR 缓 冲 液 5 mL、 25 mmol/L氯 化 镁 5 mL、 dNTP 1 mL、 引 物 F2和 R2各 1 mL、 Taq酶 5 U、 模 板 2 mL， 最 后 加 双 蒸 水 至 50 mL。 在 反 应 混 合 物 上 覆 加 25 mL矿 物 油 。5.7.3 低 速 离 心 后 将 PCR管 置 于 PCR 仪 中 ， 按 以 下 程 序 进 行 扩 增 ： 94 变 性 3 min； 94 20 s,
14、 6820 s， 72 20 s， 35个 循 环 ； 72 5 min； 4 保 温 。5.7.4 琼 脂 糖 电 泳 程 序 同 5.6。6 测 序取 PCR产 物 进 行 基 因 序 列 测 定 ， 将 测 序 结 果 与 GenBank中 参 考 序 列 （ 见 附 录 B） 进 行 同 源 性 比 对 。7 结 果 判 定7.1 检 测 样 品 第 一 次 PCR扩 增 后 在 778bp 处 出 现 条 带 ， 阳 性 对 照 在 778bp 处 出 现 条 带 ， 阴 性 对 照 和 空白 对 照 没 有 该 条 带 ； 对 检 测 样 品 PCR产 物 测 序 ， 序 列 与
15、附 录 B 中 F1至 R1序 列 相 同 ， 判 定 为 虾 肝 肠 胞 虫 阳 性 ；7.2 检 测 样 品 第 一 次 PCR扩 增 阴 性 产 物 ， 第 二 次 PCR扩 增 后 在 176 bp处 出 现 条 带 ， 阳 性 对 照 在 176bp处 出 现 条 带 ， 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 没 有 该 条 带 ； 对 检 测 样 品 的 第 二 次 PCR 产 物 测 序 ， 序 列 与 附 录 B 中F2至 R2序 列 相 同 ， 判 定 为 虾 肝 肠 胞 虫 阳 性 ； DB3301/T 10962018 4 7.3 检 测 样 品 第 一 次 和 第 二 次
16、 PCR扩 增 均 未 出 现 特 定 条 带 ， 阳 性 对 照 分 别 在 778bp 和 176bp 处 出 现 条带 ， 阴 性 对 照 和 空 白 对 照 没 有 出 现 相 关 条 带 ， 判 定 为 虾 肝 肠 胞 虫 阴 性 。AA DB3301/T 10962018 5 附 录 A（ 资 料 性 附 录 ）试 剂 配 置A.1 CTAB溶 液用 2%CTAB， 1.4 mol/L 氯 化 钠 （ NaCl） ， 20 mmol/L EDTA， 20 mol/L Tris-HCl pH7.5配 制 。 用 前加 巯 基 乙 醇 到 终 浓 度 0.25%。A.2 抽 提 液 1
17、三 氯 甲 烷 /异 戊 醇 （ 按 24:1混 合 ， 密 闭 避 光 保 存 ） 。 A.3 抽 提 液 2酚 /三 氯 甲 烷 /异 戊 醇 （ 按 25:24:1混 合 ， 密 闭 避 光 保 存 ） 。A.4 10 PCR缓 冲 液Tris-HCl 500 mmol/L pH调 至 8.8KCl 500 mmol/LTritonX-100 1%A.5 50 TAE电 泳 缓 冲 液Tris 242 g EDTA 18.612 g水 800 mL冰 乙 酸 57.1 mL用 NaOH调 pH至 8.3， 加 水 到 1000 mL， 室 温 保 存 ， 使 用 时 用 水 稀 释 50
18、倍 。A.6 EB用 水 配 制 成 10 mg/mL的 浓 缩 液 。 每 10 mL电 泳 液 或 琼 脂 中 加 1 L。A.7 样 品 缓 冲 液每 100 mL含 溴 酚 蓝 0.25 g， 蔗 糖 40 g。 DB3301/T 10962018 6 AB附 录 B（ 资 料 性 附 录 ）虾 肝 肠 胞 虫 （ EHP） 套 式 PCR检 测 产 物 序 列1CCTGAGAGATGGCTCCCACGTCCAAGGATGGCAGCAGGCGCGAAAATTGTCCACTCTTTTF161GAGAGGAGACAGTTATGAAACGTGAGTAGAAGGGTCGAGTGTAAAAACC
19、TTGACGTGAAG121CAATTGGAGGGCAAGTTTTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAACTCCAAGAGTGTCTA 181TGGTGGATGCTGCAGTTAAAGGGTCCGTAGTCGTAGATGCAATTAAAAGGTGGTGTTAAA241AGCCATTGAGTTTGTTGAGAGTAGCGGAACGGATAGGGAGCATGGTATAGGTGGGCAAAG301AATGAAATCTCAAGACCCCACCTGGACCAACGGAGGCGAAAGCGATGCTCTTAGACGTAT361CTGGGGATCAAGGACGAAGGCTAGAGTATCGAA
20、AGTGATTAGACACCGCTGTAGTTCTAG421CAGTAAACTATGCCGACAATGCTGGGTGTTGCGAGAGCGATGCTTGGTGTGGGAGAAATC481TTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGCTCGCAAGGGTGAAACTTAAAGCGAAATTGAC 541GGAAGGACACTACCAGGAGTGGATTGTGCTGCTTAATTTAACTCAACGCGGGAAAACTTAF2601CCAGGGTCAAGTCTATCGTAGATTGGAGACATGAGGTAGACAAGAGTGGTGCATGGCCGT661TGGAAATTGATGGGGCGACTTTTAGCTTAAGTGCTGGAACCAGTGAGATCTTCTAGACAG721GTGTTATTTAGGCACAGGAGGGAGAAGGCAATAACAGGTCCGTGATGCCCTTAGATATCCR2781TGGGCAGCAAGCGCAATACAATATCTCTTGAGAAGACAAAGCAATTGAGATGAGTAGGATR1_
