1、ICS 65.020.20B 05 DB2310牡 丹 江 市 地 方 标 准DB 2310/T 007 2019黑 木 耳 液 体 菌 种 生 产 技 术 规 程 2019 -12- 02发 布 2019- 12-02实 施牡 丹 江 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB2310/T 0072019 I 前 言本 标 准 依 据 GB/T 1.1-2009的 编 写 规 则 起 草 。本 标 准 由 黑 龙 江 省 食 用 菌 标 准 化 技 术 委 员 会 牡 丹 江 分 委 员 会 提 出 并 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 牡 丹
2、江 分 院 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 王 延 锋 、 于 海 洋 、 张 运 岐 、 罗 连 富 、 贾 利 阳 、 杨 峰 山 、 丁 仕 波 、 史 磊 、 张 荣 芳 、高 天 一 、 董 雪 梅 、 王 金 贺 、 刘 姿 彤 、 谷 维 、 潘 春 磊 、 盛 春 鸽 、 张 鹏 、 宋 佳 鑫 、 赵 鹤 、 赵 静 。 DB2310/T 0072019 1 黑 木 耳 液 体 菌 种 生 产 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 黑 木 耳 (Auricularia heimuer)液 体 菌 种 生 产 的 生 产 条 件 、 菌 种 选 择 、 液 体
3、菌 种 生 产 技 术 要 求 、菌 种 保 藏 及 运 输 、 记 录 与 档 案 。本 标 准 适 用 于 黑 木 耳 液 体 菌 种 的 生 产 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 GB 150 压 力 容 器GB 3095 环 境 空 气 质 量 标 准GB 5749 生 活 饮
4、用 水 卫 生 标 准GB/T 11165 实 验 室 pH计GB/T 12728 食 用 菌 术 语GB/T 13554 高 效 空 气 过 滤 器GB 15618 土 壤 环 境 质 量 农 用 地 土 壤 污 染 风 险 管 控 标 准GB 22207 容 积 式 空 气 压 缩 机 安 全 要 求GB 50073 洁 净 厂 房 设 计 规 范NY/T 528 食 用 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程NY/T 2375 食 用 菌 生 产 技 术 规 范3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 品 种经 不 同 方 法 选 育 出 来 的
5、具 有 特 异 性 、 遗 传 型 、 稳 定 性 ， 适 用 于 液 体 发 酵 、 固 体 栽 培 的 食 用 菌 菌 种 。3.2 黑 木 耳 液 体 菌 种用 液 体 培 养 基 ， 在 生 物 发 酵 罐 中 ， 通 过 深 层 培 养 （ 液 体 发 酵 ） 技 术 生 产 的 液 体 形 态 的 黑 木 耳 菌 种 。3.3 液 体 菌 种 发 酵 罐也 称 之 为 食 用 菌 液 体 菌 种 培 养 器 ， 是 指 进 行 食 用 菌 液 体 菌 种 培 养 的 专 用 设 备 。 要 求 不 锈 钢 材 质 ， 符 DB2310/T 0072019 2 合 GB 150要 求
6、 。3.4 起 始 pH液 体 培 养 基 配 制 后 尚 未 灭 菌 的 pH。3.5 终 止 pH液 体 菌 种 达 到 放 罐 指 标 时 的 培 养 基 pH。3.6 发 酵 罐 空 消对 尚 未 投 料 的 空 发 酵 罐 进 行 高 压 蒸 汽 灭 菌 。 3.7 发 酵 罐 实 消对 投 料 后 的 发 酵 罐 及 发 酵 罐 内 培 养 基 进 行 高 压 蒸 汽 灭 菌 。3.8 接 种 量接 入 发 酵 罐 中 的 食 用 菌 菌 种 的 数 量 ， 以 菌 种 体 积 与 培 养 基 体 积 的 百 分 比 表 示 。3.9 通 风 量发 酵 罐 培 养 液 体 菌 种
7、过 程 中 每 分 钟 通 入 培 养 基 的 无 菌 空 气 的 量 ， 以 培 养 基 体 积 /通 入 空 气 体 积 表 示 。3.10 液 体 菌 种 菌 龄指 菌 种 接 入 培 养 基 后 ， 液 体 菌 种 的 生 长 发 育 时 间 。3.11放 罐液 体 菌 种 菌 丝 生 长 旺 盛 ， 达 到 生 长 对 数 期 时 结 束 培 养 ， 在 无 菌 条 件 下 从 发 酵 罐 通 过 传 送 管 在 0.15MPa压 力 下 ， 注 射 接 种 到 栽 培 袋 中 。3.12镜 检指 通 过 显 微 镜 观 察 液 体 菌 种 的 菌 丝 生 长 发 育 状 态 以 及
8、 是 否 有 杂 菌 污 染 。4 生 产 条 件 4.1 厂 址 选 择 DB2310/T 0072019 3 应 建 立 在 交 通 便 利 ， 地 势 干 燥 ， 通 风 良 好 ， 水 源 充 足 ， 远 离 禽 畜 舍 、 垃 圾 堆 积 场 ， 无 污 水 、 废 气 、 废渣 和 粉 尘 等 污 染 源 。 水 质 应 符 合 GB 5749的 规 定 ； 大 气 应 符 合 GB 3095的 规 定 ； 土 壤 环 境 质 量 应 符 合 GB15618的 规 定 。4.2 厂 房 设 置 和 布 局液 体 发 酵 间 和 接 种 间 按 照 GB 50073洁 净 厂 房 设
9、 计 规 范 执 行 ， 应 按 液 体 菌 种 生 产 工 艺 流 程 合 理 安 排 布局 ， 无 菌 区 与 有 菌 区 有 效 隔 离 。4.3 基 础 设 备菌 种 配 制 室 、 灭 菌 室 、 无 菌 净 化 操 作 室 、 恒 温 培 养 室 、 发 酵 罐 培 养 室 、 化 验 室 和 菌 种 室 ， 要 有 调 温 设施 ， 排 水 系 统 ， 排 气 设 备 ， 进 入 无 菌 区 缓 冲 间 ， 规 模 要 配 套 ， 布 局 合 理 。4.4 生 产 仪 器 和 设 备 发 酵 罐 应 符 合 GB 150的 规 定 。空 气 过 滤 器 应 符 合 GB/T 13
10、554的 规 定 。空 气 压 缩 机 应 符 合 GB 19153的 规 定 。高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 应 符 合 GB 150的 规 定净 化 工 作 台 、 冰 箱 、 磅 秤 、 天 平 、 液 体 菌 种 接 种 枪 、 恒 温 回 旋 式 振 荡 器 应 符 合 相 关 的 使 用 规 定 。4.5 检 验 设 备恒 温 培 养 箱 、 显 微 镜 、 天 平 、 酸 度 计 等 、 玻 璃 三 角 瓶 、 试 管 、 培 养 皿 、 定 量 定 性 滤 纸 、 精 密 pH 试 纸等 。5 菌 种 选 择应 选 用 适 于 当 地 栽 培 、 发 菌 出 耳 及 转 潮 快
11、、 抗 逆 性 强 、 优 质 、 高 产 、 商 品 性 好 ， 经 省 级 以 上 农 作 物 品 种 审 定 委 员 会 审 （ 认 ） 定 的 品 种 。 菌 种 生 产 应 符 合 NY/T 528的 规 定 。6 液 体 菌 种 生 产 技 术 要 求6.1 工 艺 流 程按 照 图 1的 工 艺 流 程 进 行 黑 木 耳 液 体 菌 种 的 生 产 。 DB2310/T 0072019 4 图 1 液 体 菌 种 生 产 工 艺 流 程6.2 母 种 制 备6.2.1 母 种 培 养 基 的 制 作按 照 附 录 A.1配 方 配 制 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基
12、 （ PDA） 或 附 录 A.2配 方 配 制 综 合 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂培 养 基 （ CPDA） ， 分 装 至 试 管 长 度 五 分 之 一 处 ， 使 用 棉 塞 或 胶 塞 封 住 试 管 口 ， 放 入 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 中 ， 温度 121 ， 灭 菌 30min， 灭 菌 结 束 摆 放 斜 面 冷 却 凝 固 。6.2.2 接 种 与 培 养无 菌 条 件 下 ， 用 接 种 钩 取 黄 豆 粒 大 小 的 原 始 菌 种 接 种 在 母 种 培 养 基 上 恒 温 培 养 箱 中 培 养 ， 培 养 温 度25 1 ， 相 对 湿 度 50%-70
13、%， 避 光 培 养 10d-15d。6.3 摇 瓶 菌 种 制 备 6.3.1 摇 瓶 培 养 基 的 制 作按 照 附 录 B.1配 方 配 制 培 养 基 ， 用 水 应 符 合 GB 5749要 求 。 将 配 方 中 的 原 料 煮 沸 20min-30min， 宜 用三 层 纱 布 过 滤 ， 将 滤 液 分 装 入 500mL-1000mL三 角 瓶 中 ， 装 液 量 为 三 角 瓶 容 积 的 70%， 放 入 15-20个 玻 璃 珠 ，用 封 口 膜 封 口 ， 灭 菌 压 力 为 0.125Mpa， 灭 菌 时 间 40min。 灭 菌 时 加 盖 牛 皮 纸 防 潮
14、。6.3.2 接 种 与 培 养无 菌 条 件 下 ， 用 接 种 铲 将 母 种 接 入 摇 瓶 液 体 培 养 基 中 ， 每 瓶 接 15-20块 ， 接 种 完 成 贴 好 标 签 置 于 25恒 温 培 养 箱 内 静 置 24h后 放 置 震 荡 培 养 箱 内 振 荡 培 养 ， 震 荡 频 率 为 150r/min-180r/min， 培 养 时 间 为 5d-7d，培 养 温 度 为 25 -28 。 培 养 期 间 定 期 检 查 ， 除 去 污 染 或 异 常 菌 种 ， 并 留 样 用 于 检 测 。6.4 液 体 菌 种 制 备6.4.1 投 料 前 准 备 检 查
15、发 酵 罐 罐 体 有 无 变 形 ， 全 部 阀 门 、 压 力 表 、 控 制 面 板 ， 有 内 置 电 加 热 棒 的 发 酵 罐 ， 加 热 棒 是 否 完好 ， 有 无 漏 电 ， 是 否 能 够 正 常 工 作 。对 罐 体 内 、 外 用 流 水 进 行 冲 洗 ， 达 到 无 死 角 、 内 壁 无 任 何 培 养 料 残 余 物 。 DB2310/T 0072019 5 发 酵 罐 每 次 使 用 前 要 对 罐 体 进 行 空 消 ， 有 内 置 加 热 棒 的 空 消 时 加 水 必 须 没 过 加 热 棒 ， 121 -124灭 菌 60min； 用 外 源 蒸 汽
16、灭 菌 的 发 酵 罐 ， 蒸 汽 压 力 达 到 0.105Mpa-0.125Mpa， 121 -124 灭 菌 40min。6.4.2 液 体 培 养 基 的 制 作按 照 附 录 B.2配 方 配 制 培 养 基 ， 用 水 应 符 合 GB 5749要 求 。6.4.3 投 料 与 定 容将 原 材 料 用 冷 水 溶 解 ， 倒 入 或 用 泵 抽 入 发 酵 罐 中 ， 加 水 定 容 至 罐 体 规 定 体 积 ， 如 果 用 到 马 铃 薯 等 固 体原 料 需 要 提 前 用 开 水 煮 沸 30min， 宜 用 三 层 纱 布 过 滤 ， 再 将 滤 液 与 其 他 培 养
17、 料 搅 拌 均 匀 。6.4.4 起 始 pH起 始 pH为 6.5-6.8， 如 需 调 节 可 用 盐 酸 和 氢 氧 化 钠 。 6.4.5 发 酵 罐 实 消发 酵 罐 内 蒸 汽 压 力 达 到 0.125 Mpa， 温 度 达 到 124 时 ， 内 置 罐 需 下 排 料 1次 ， 外 置 罐 需 要 上 下 排 料各 1次 ， 灭 菌 时 间 保 持 60min， 温 度 上 升 过 程 需 将 排 气 阀 微 开 防 止 罐 体 内 形 成 假 压 ， 保 压 过 程 保 持 排 气 阀微 开 。6.4.6 冷 却灭 菌 结 束 后 将 冷 水 通 入 发 酵 罐 夹 层
18、或 内 置 冷 却 系 统 中 循 环 降 温 ， 降 温 过 程 中 向 发 酵 罐 内 通 入 无 菌 空 气同 时 打 开 排 气 阀 ， 培 养 基 温 度 降 温 至 24 -28 停 止 通 入 冷 凝 水 ， 罐 内 压 力 维 持 在 0.05Mpa。6.4.7 接 种按 下 列 步 骤 完 成 ：a） 用 无 菌 水 喷 洒 发 酵 罐 上 方 进 行 降 尘 处 理 ； b） 在 接 种 口 放 置 内 径 略 大 于 接 种 口 并 蘸 有 95%酒 精 的 纱 布 火 焰 圈 ， 点 燃 火 焰 圈 ；c） 调 节 压 力 表 ， 使 发 酵 罐 内 压 降 至 0.0
19、1Mpa， 打 开 入 料 口 同 时 关 闭 排 气 阀 ， 火 焰 旁 打 开 已 经 表 面 消 毒的 摇 瓶 菌 种 封 口 膜 ， 灼 烧 瓶 口 后 迅 速 将 菌 种 倒 入 发 酵 罐 中 ；d） 用 火 焰 外 焰 灼 烧 接 种 口 盖 ， 迅 速 拧 紧 ， 移 走 火 焰 圈 同 时 打 开 排 气 阀 ， 调 整 压 力 表 保 持 发 酵 罐 压 力在 0.03Mpa-0.05Mpa。6.4.8 液 体 菌 种 培 养培 养 阶 段 应 满 足 下 列 条 件 ：a) 罐 内 换 气 量 1 0.5 -1： 1.2 V V(料 液 体 积 空 气 体 积 )；b)
20、罐 压 保 持 在 0.03Mpa-0.05 Mpa；c) 培 养 温 度 24 -28 ；d) 培 养 时 间 5d-7d。 6.4.9 液 体 菌 种 检 测取 样 ： 接 种 1d后 进 行 隔 天 检 测 ， 用 酒 精 灯 外 焰 灼 烧 取 样 阀 ， 弃 掉 最 初 流 出 液 体 ， 取 一 定 量 的 液 体 流入 无 菌 三 角 瓶 中 ， 备 用 。 DB2310/T 0072019 6 检 测 ： 将 样 品 在 PDA平 板 培 养 基 上 培 养 ， 观 察 是 否 有 杂 菌 污 染 ， 无 杂 菌 污 染 观 察 菌 落 生 长 情 况 ， 达 到放 罐 指 标
21、 （ 见 附 录 C） 即 可 放 罐 ， 放 罐 前 48h对 菌 种 进 行 再 次 检 测 。6.5 留 样菌 种 和 培 养 基 均 应 留 样 备 查 ：a) 母 种 以 每 个 批 号 3支 -5支 ， 于 4 冰 箱 下 贮 存 ， 贮 存 至 经 转 接 的 栽 培 袋 正 常 发 菌 ；b) 摇 瓶 菌 种 使 用 时 取 样 30 mL-40 mL， 用 三 角 瓶 留 存 ；c) 发 酵 罐 实 消 后 的 空 白 培 养 基 取 样 30 mL-40 mL， 用 三 角 瓶 留 存 ；d) 放 罐 前 48h从 发 酵 罐 中 取 样 30 mL-40 mL， 用 三
22、角 瓶 留 存 ；e) 发 酵 终 止 后 取 样 80 mL-100 mL， 用 三 角 瓶 留 存 。注 ： 样 品 放 置 2 -4 保 存 7天 。7 菌 种 保 藏 及 运 输 液 体 菌 种 生 产 好 后 ， 应 立 即 进 入 菌 种 生 产 或 栽 培 袋 接 种 使 用 ， 若 因 某 些 原 因 不 能 立 即 使 用 时 需 降 温 保压 处 理 。 一 般 在 4 10 下 存 放 不 超 过 2d。 液 体 菌 种 不 宜 长 途 运 输 。8 记 录 与 档 案应 建 立 生 产 档 案 ， 内 容 包 括 产 地 环 境 、 品 种 选 择 和 质 量 要 求
23、， 母 种 、 摇 瓶 液 体 种 和 发 酵 罐 液 体 菌 种 生产 的 每 个 环 节 等 。 生 产 记 录 由 具 体 操 作 人 员 现 场 记 录 填 写 ， 定 期 由 主 管 领 导 审 核 ， 签 字 后 归 档 ， 档 案 保 存至 少 3 年 。 DB2310/T 0072019 7 附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）常 用 母 种 培 养 基 及 配 方A.1 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 （ PDA） 配 方 ： 马 铃 薯 200g（ 浸 出 汁 ） ， 葡 萄 糖 20g， 琼 脂 20g， 水 定 容 至1000mL， pH自 然 。A.2 综
24、 合 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 （ CPDA） 配 方 ： 马 铃 薯 200g（ 浸 出 汁 ） ， 葡 萄 糖 20g， 琼 脂 20g， 磷酸 二 氢 钾 1g， 硫 酸 镁 0.5g， 水 定 容 至 1000mL， pH自 然 。 DB2310/T 0072019 8 附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）黑 木 耳 液 体 菌 种 培 养 基 参 考 配 方AB.1 摇 瓶 液 体 培 养 基 配 方 ： 土 豆 200 g， 葡 萄 糖 20 g， 蛋 白 胨 3 g， 磷 酸 二 氢 钾 1 g， 硫 酸 镁 0.5 g， 水 1000mL。B.2 发 酵 罐
25、液 体 培 养 基 配 方 ： 葡 萄 糖 1%， 蔗 糖 1%， 麸 皮 0.5%， 蛋 白 胨 0.25%， 酵 母 膏 0.05%， 磷 酸 二氢 钾 0.05%， 硫 酸 镁 0.05%， VB 15 mg/L， 消 泡 剂 0.015%。 DB2310/T 0072019 9 附 录 C（ 规 范 性 附 录 ）黑 木 耳 液 体 菌 种 培 养 放 罐 指 标放 罐 指 标 见 表 C.1。 表 C.1 放 罐 指 标项 目 指 标发 酵 液 色 泽 球 状 菌 丝 体 因 品 种 而 异 ， 一 般 呈 白 色 ， 滤 液 呈 淡 黄 色 或 黄 褐 色 ， 清澈 透 明 。 菌
26、 液 形 态 菌 液 稍 粘 稠 ， 菌 丝 体 稠 密 且 均 匀 分 布 ， 菌 液 不 混 浊 。菌 液 气 味 无 酸 、 臭 味 、 霉 味 、 发 酵 酒 精 味 等 异 味 。pH 5.5-6.0。菌 丝 体 湿 重 （ g/100mL） 8显 微 镜 下 菌 丝 形 态 黑 木 耳 菌 种 液 体 培 养 中 特 有 的 球 状 和 从 状 菌 丝 形 态 ， 菌 丝 粗 壮 ， 分布 均 匀样 品 无 菌 检 查 无 霉 菌 、 细 菌 、 酵 母 菌 等 杂 菌 菌 落 生 长 DB2310/T 0072019 10 附 录 D（ 资 料 性 附 录 ）黑 木 耳 液 体
27、菌 种 培 养 检 验 项 目检 验 项 目 见 表 D.1。 表 D.1 检 验 项 目项 目 指 标 检 验 方 法菌 液 颜 色 和 透 明 度 呈 淡 黄 色 或 黄 褐 色 ， 清 澈 透 明 。 感 官 鉴 定 菌 液 形 态 菌 液 稍 粘 稠 ， 菌 丝 体 稠 密 且 均 匀 分 布 ， 菌液 不 混 浊 。 感 官 鉴 定菌 液 气 味 无 酸 、 臭 味 、 发 酵 酒 精 味 等 气 味 。 感 官 鉴 定菌 丝 形 态 可 见 黑 木 耳 菌 种 液 体 培 养 中 特 有 的 菌 丝形 态 ， 大 量 分 枝 菌 丝 分 布 ， 菌 丝 纤 细 ， 有锁 状 联 合
28、 ， 菌 丝 内 原 生 质 分 布 均 匀 、 染 色剂 着 色 深 。 显 微 镜 （ 低 倍 镜 、 高 倍 镜 、油 镜 ） DB2310/T 0072019 11 无 霉 菌 菌 丝 、 酵 母 和 细 菌 菌 体 。菌 丝 活 力 黑 木 耳 菌 丝 在 固 体 培 养 基 上 正 常 生 长 ， 无杂 菌 生 长 。 取 样 接 种 到 装 有 无 菌 的 木屑 培 养 基 中 ， 28 恒 温 培 养2d-5d， 观 察 菌 丝 生 长 情 况 。杂 菌 检 测 无 霉 菌 、 细 菌 、 酵 母 菌 等 杂 菌 菌 落 生 长 取 样 接 种 到 肉 汤 培 养 基 、 营养 琼 脂 培 养 基 划 线 培 养 ， 分别 在 28 和 37 恒 温 培 养2d-5d， 观 察 菌 落 生 长 情 况 。 _
