1、ICS 65.020.20CCS B 39 DB1302唐 山 市 地 方 标 准DB1302/T 523-2020平 茹 原 生 质 体 再 生 复 壮 技 术 规 程 2020-12-28 发 布 2021-01-10 实 施唐 山 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB1302/T 523-2020 I 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草 。本 文 件 由 唐 山 市 农 业 农 村 局 提 出 并 归 口 。本 文 件 起 草 单 位 ： 唐 山
2、师 范 学 院 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 范 永 山 、 武 秋 颖 、 张 运 峰 、 张 淑 红 、 高 凤 菊 、 石 洪 凌 、 李 艳 梅 、 商 艳 朝 、 李 蕊 、张 春 刚 、 倪 玉 杰 、 徐 树 杰 、 史 晓 贤 、 韩 靖 琳 、 刘 海 英 。 DB1302/T 523 2020 1 平 茹 原 生 质 体 再 生 复 壮 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 平 菇 原 生 质 体 再 生 复 壮 的 术 语 和 定 义 、 人 员 和 设 备 、 出 发 菌 株 制 备 、 再 生 复 壮 、 再 生菌 株 筛 选 和 稳 定 性 检 测
3、 。本 文 件 适 用 于 平 菇 （ Pleurotus ostreatus） 原 生 质 体 再 生 复 壮 。 白 灵 菇 （ Pleurotus ferulae） 和 杏 鲍 菇（ Pleurotus eryngii） 等 其 它 食 用 菌 的 原 生 质 体 再 生 复 壮 可 参 照 执 行 。2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。 不 注 日 期 的
4、引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本文 件 。GB/T 23189 平 菇NY/T 528 食 用 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程NY/T 2375 食 用 菌 生 产 技 术 规 范LS/T 6132 粮 油 检 验 储 粮 真 菌 的 检 测 孢 子 计 数 法3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 出 发 菌 株 种 性 退 化 或 缺 失 需 要 复 壮 的 原 始 菌 株 。3.2 原 生 质 体脱 去 细 胞 壁 的 植 物 、 真 菌 或 细 菌 细 胞 。3.3 原 生 质
5、 体 再 生 菌 株经 过 原 生 质 体 再 生 获 得 的 遗 传 性 状 稳 定 的 菌 株 。3.4 原 生 质 体 再 生 复 壮从 原 生 质 体 再 生 菌 株 群 体 中 筛 选 出 恢 复 或 超 过 出 发 菌 株 原 有 优 良 性 状 的 技 术 。4 人 员 和 设 备 4.1 人 员熟 悉 基 本 微 生 物 操 作 ， 充 分 掌 握 安 全 操 作 规 范 。 DB1302/T 523 2020 2 4.2 实 验 室应 符 合 BSL-1实 验 室 的 要 求 。 GB 19489-2008中 6.1给 出 了 建 设 BSL-1实 验 室 的 条 件 。4.
6、3 设 备4.3.1 超 净 工 作 台 ： 无 菌 风 的 纯 度 0.5个 /皿 时 ( 90 mm培 养 平 皿 )， 风 速 可 调 。4.3.2 高 压 蒸 汽 灭 菌 器 ： 温 度 控 制 在 121 0.5 。4.3.3 恒 温 培 养 箱 ： 温 度 控 制 在 22 28 。4.3.4 光 学 显 微 镜 ： 放 大 倍 数 100400倍 。4.3.5 离 心 机 ： 转 速 控 制 在 2500 r/min。4.4 试 剂 和 培 养 基4.4.1 稳 渗 剂 ： 0.6 mol/L甘 露 醇 ， 用 无 菌 水 配 制 ； 121 0.5 高 压 蒸 汽 灭 菌 20
7、 min。 4.4.2 细 胞 壁 降 解 液 ： 2.0%溶 壁 酶 液 ， 用 稳 渗 剂 配 制 ， 0.22 m微 孔 滤 膜 过 滤 。 现 配 现 用 。4.4.3 PDA培 养 基 ： 马 铃 薯 200 g， 葡 萄 糖 20 g， 琼 脂 15 g， 水 1000 mL。4.4.4 原 生 质 体 固 体 再 生 培 养 基 ： 蔗 糖 20 g， 蛋 白 胨 5 g， 琼 脂 15 g， 稳 渗 剂 1000 mL； 121 0.5 高压 蒸 汽 灭 菌 20 min。5 出 发 菌 株 制 备5.1 来 源来 自 种 性 退 化 的 人 工 栽 培 平 菇 子 实 体 或
8、 菌 种 。 人 工 栽 培 平 菇 应 符 合 GB/T 23189 的 规 定 ， 平 菇 菌 种应 符 合 菌 种 质 量 要 求 。 GB 19172 给 出 了 菌 种 质 量 要 求 。5.2 制 备 过 程 将 子 实 体 组 织 或 菌 种 菌 丝 接 种 至 PDA 培 养 基 中 ， 恒 温 培 养 箱 中 培 养 7 d， 产 生 大 量 生 长 旺 盛 的 菌 丝即 获 得 出 发 菌 株 。 接 种 过 程 在 超 净 工 作 台 中 进 行 ， 所 用 试 验 材 料 和 器 具 需 提 前 进 行 消 毒 或 灭 菌 。 获 得 出发 菌 株 后 立 即 开 始
9、原 生 质 体 制 备 。6 再 生 复 壮6.1 原 生 质 体 制 备6.1.1 制 备 过 程6.1.1.1 挑 取 出 发 菌 株 幼 嫩 菌 丝 球 至 1.5 mL 离 心 管 内 ， 加 入 1.0 mL 稳 渗 剂 ， 2500 r/min 离 心 10 min，弃 上 清 液 ， 重 复 洗 涤 3次 ， 滤 纸 吸 干 菌 丝 球 表 面 多 余 液 体 ， 用 天 平 称 取 菌 丝 湿 重 。6.1.1.2 每 0.1 g 菌 丝 加 入 1 mL 细 胞 壁 降 解 液 ， 混 匀 ， 在 35 下 水 浴 加 热 酶 解 2.5 h。6.1.1.3 用 孔 径 48
10、 m 的 细 胞 筛 过 滤 酶 液 ， 除 去 残 留 菌 丝 。 6.1.1.4 2500 r/min 离 心 2 min， 弃 上 清 液 ， 沉 淀 加 入 适 量 稳 渗 剂 ， 重 复 洗 涤 2 次 ， 获 得 原 生 质 体 悬 液 。6.1.2 观 察 和 计 数利 用 光 学 显 微 镜 观 察 原 生 质 体 悬 液 ， 按 LS/T 6132 的 规 定 进 行 原 生 质 体 计 数 ， 计 算 原 生 质 体 悬 液的 浓 度 （ 个 每 毫 升 ） 。 DB1302/T 523 2020 3 6.2 原 生 质 体 再 生取 0.5 mL 浓 度 为 1.0 10
11、5 1.0 107个 每 毫 升 原 生 质 体 悬 液 均 匀 涂 布 在 原 生 质 体 再 生 固 体 培 养 基上 ， 25 恒 温 培 养 至 长 出 单 菌 落 。6.3 再 生 菌 株 培 养将 再 生 过 程 中 产 生 的 单 菌 落 分 别 在 PDA 培 养 基 上 单 独 培 养 23 代 ， 选 择 各 代 培 养 时 菌 丝 和 菌 落 形态 均 一 致 的 单 菌 落 作 为 再 生 菌 株 。 再 生 菌 株 应 单 独 编 号 保 存 ， 不 能 与 其 它 再 生 菌 株 混 杂 。7 再 生 菌 株 筛 选7.1 按 NY/T 528制 备 菌 种 ， 考
12、 察 再 生 菌 株 和 出 发 菌 株 菌 丝 长 势 、 长 速 、 抗 杂 菌 能 力 等 。7.2 按 NY/T 2375制 作 出 菇 菌 棒 ， 考 察 再 生 菌 株 和 出 发 菌 株 发 菌 时 间 、 满 袋 天 数 、 抗 病 性 等 。 7.3 按 NY/T 2375进 行 出 菇 试 验 ， 考 察 再 生 菌 株 和 出 发 菌 株 农 艺 性 状 、 品 质 、 产 量 等 ； 综 合 菌 丝 和 子实 体 生 长 与 产 量 结 果 ， 筛 选 出 恢 复 或 超 过 出 发 菌 株 原 有 优 良 性 状 的 再 生 菌 株 。8 稳 定 性 检 测8.1 按 NY/T 2375进 行 生 产 栽 培 中 试 ， 进 一 步 考 察 筛 选 的 再 生 菌 株 优 良 性 状 稳 定 性 。8.2 选 择 表 现 稳 定 且 优 于 当 前 主 栽 品 种 的 再 生 菌 株 ， 用 于 生 产 。 DB1302/T 523 2020 4 参 考 文 献1 GB 19489-2008 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求2 GB 19172 平 菇 菌 种
