1、ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省 地 方 标 准 DB51/T 2685 2020 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（ CPA） 检测方法 2020 - 7 - 14 发布 2020 - 8 - 1 实施 四川省市场监督管理局 发布 DB51/T 2685 2020 I 目 次 前言 . I 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 仪器 . 2 5 耗材 . 2 6 试剂 . 2 7 样品采集和处理 . 2 8 CPA 操作程序 . 3 9 样品处理及生物安全管控措施 . 5 附录 A （规范性附录） 溶液配制 . 6 附录 B （规范性附录）
2、引物 . 7 附录 C （规范性附录） CPA 反应体系 . 8 DB51/T 2685 2020 II 前 言 本规范依据 GB/T1.1-2009给出的规定进行编写。 本标准由四川省农业农村厅提出归口 并负责解释 。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准由四川省动物疫病预防控制中心、四川纳比生物科技有限公司负责起 草。 本标准主要起草人：陈斌、周明忠、陈弟诗、袁旦一、李晓琪、裴超信、张毅、邓飞、李丽、邵靓、 陈冬、蔡冬冬、丁梦蝶、邱明双、周莉媛、张睿、辜良斌 。 DB51/T 2685 2020 1 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（ CPA） 检测方法 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病
3、毒的交叉引物恒温扩增（ CPA）检测方法。 本标准适用于四川省行政区域范围内猪伪狂犬病毒核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求 GB/T 25172-2010 猪常温精液生产与保存技术规范 SN/T 3567.1-2013 交叉引物恒温扩增检测方法 第 1部分：通用技术规程 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 CPA 交叉
4、引物恒温扩增（ Crossing Primming Amplification） 3.2 DNA 脱氧核糖核酸（ deoxyribomucleic acid） 3.3 Bst 酶 Bst DNA聚合酶（ Bst DNA polymerase） 3.4 TE 缓冲液 Tris-EDTA缓冲液（ Tris-EDTA buffer） 3.5 PRV 伪狂犬病毒（ pseudorabies virus） 3.6 PBS 磷酸盐缓冲液 DB51/T 2685 2020 2 4 仪器 4.1 恒温金属浴。 4.2 高速台式冷冻离心机。 4.3 组织研磨仪或研钵。 4.4 普通冰箱： 2 8。 4.5 普通
5、冰柜： -20以下。 4.6 超低温冰箱：可控温至 -70。 4.7 微量移液器： 0.2L 2.5L、 2L 20L、 20L 200L、 100L 1000L，并配备与移液器匹配 的吸头。 4.8 高压灭菌锅。 4.9 干烤灭菌器。 4.10 普通 PCR 仪。 5 耗材 5.1 1.5mL 离心管。 5.2 0.2mLPCR 薄壁管或八连管。 5.3 PCR 管漂浮板。 6 试剂 6.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。 6.2 DNAzol 于 2-8保存；商品化 DNA 提取试剂按说明书要求条件保存。 6.3 无水乙醇， -2
6、0预冷。 6.4 75%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制， -20预冷。 6.5 8mmol/LNaOH 溶液，配制见附录 A。 6.6 PBS 缓冲液，配制见附录 A。 6.7 Bst 酶及 Bst 酶反应缓冲液： Bst 酶浓度为 8U/L， Bst 酶反应缓冲液为 10Thermopol* Buffer， Mg2+ 浓度为 100mmol/L。 6.8 dNTP Mix：含 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP 各 10mmol/L,-20保存，避免反复冻融。 6.9 引物序列参见附录 B。 6.10 伪狂犬病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒， -20
7、保 存备用；阴性对照可采用 ddH2O。 6.11 石蜡油，按说明书要求条件保存。 7 样品采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 手术刀、剪刀、镊子，经 160干热灭菌 2h 或高压灭菌烘干。 7.1.2 一次性无菌棉拭子。 7.1.3 组织研磨器或者研钵，经 160干热灭菌 2h 或高压灭菌烘干。 7.1.4 一次性注射器 /真空采血管。 DB51/T 2685 2020 3 7.2 样品采集 7.2.1 血液样品采集：用含有 EDTA 的真空采血管采集血液，充分混匀，编号备用。 7.2.2 血清样品采集：不含有 EDTA 的真空采血管时，采血后静置析出血清，将血清转入离心管编号 备用。
8、 7.2.3 精液样品采集：按照 GB/T 25172-2010 中第 4、 8 章节的方法采集和保存精液。 7.2.4 鼻拭子样品采集：用棉拭子取受检动物鼻腔分泌物，置于 2mlPBS 缓冲液中备用。 7.2.5 组织样品采集：取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等组 织 5-10g，置于无菌离心管内，编号备用。 7.3 样品保存和运输 采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样 品，在 2 -8 下保存应不超过 24h， -20 5 下 应不超过 3个月， -70 以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内 送达。 7.4 样品处理
9、7.4.1 血液和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。 7.4.2 鼻拭子样品：充分震荡洗脱含有鼻拭子的管子 1min 左右，弃去拭子后静置 5min，取上清用于 后续的核酸提取。 7.4.3 组织样品：取 2g 左右的组织，剪碎，加入 1-2mlPBS 缓冲液进行研磨至匀浆状态， 8000r/min， 离心 1min 取上清用于后续的核酸提取。 8 CPA 操作程序 8.1 DNA 提取试剂 8.1.1 核酸提取区进行操作 。 DNA 提取使用 DNAzol 手工提取，也可以使用商品化试剂盒提取。 8.1.2 取 n 个灭菌的 1.5ml 离心管，其中 n 为待检样品数量加上阴阳性对照
10、，对每个离心管进行编号。 8.1.3 每管先加入 800LDNAzol，再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 L，颠倒 10 次 混匀， 4或室温 10000 r/min 离心 10min。 8.1.4 取 900L 上清，置于新的 1.5ml 离心管中，加入 500 L 无水乙醇，混匀，室温放置 3min； 4 或室温 10000 r/min 离心 5min。 8.1.5 弃上清，沿管壁缓缓加入 0.8mL-1 mL 乙醇，颠倒 3-6 次混匀， 4 10000 r/min 离心 5min。反 复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。 8.1.6 用 3
11、0L 8mmol/L NaOH 溶液溶解沉淀， DNA 在 2-8冰箱可保存两个月， -20冰柜可保存 2 年左右。 8.2 CPA 反应 8.2.1 反应体系的配制 在试剂准备区进行。设 CPA反应管为 n, n为待检样品数量加上阴阳性对照，每个反应的体系见附录 C，为了避免移液器取样损失，建议按 n+1反应进行配制。 8.2.2 反应液的分装 DB51/T 2685 2020 4 将 8.2.1中配制的 CPA反应液充分混匀，按照每管 16 L分装于 0.2mL透明 PCR管内，按顺序加样并做 好标识，转移至核酸提取区。 8.2.3 加样 在核酸提取区进行。在每个 PCR反应管中分别加入
12、8.1制备的 DNA核酸溶液 4L，再向每管滴加 20L 石蜡油，盖上盖子，将反应管以大于 4000 r/min瞬时离心 3-5秒。转移至检测区。 8.2.4 CPA 扩增 方法一：将 PCR反应管置恒温设备（水浴锅、金属浴）上， 63 避光温浴 35min。 方法一：实验室若暂时无石蜡油，可将 PCR管置于普通 PCR仪，程序设置热盖 105 ，样品孔 63 ， 35min。 8.2.5 结果判定 8.2.5.1 操作程序 将恒温扩增后的 PCR反应管（不可开盖，以避免污染 ）放入一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸 条）（按照 SN/T 3567.1-2013中附录 B操作），检查液泡有无漏
13、液以及是否在下图（图 1）所示位置，合 上核酸检测装置内芯后将其装入装置外盒。 图 1 操作示意图 注 1： 按手柄至检测装置于关闭状态，将检测装置放置在操作台上，同时开始计时。 15min-30min内通过阅读窗判读 结果并记录结果， 30min后判读结果无效。 8.2.5.2 结果描述及判定 试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区（ C线），一条位于检测区（ T线），结果判定为阳性。 试纸条质控区（ C线）出现一条红色条带，检测区（ T线） 没有条带，结果判定为阴性。 试纸条质控区（ C线）和检测区（ T线）均未出现条带，或仅检测区（ T线）出现红色条带，检测结 果无效。表明试纸条已损坏、
14、失效或者操作有误。此时应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。 （图 2） 图 2 检测结果判读示意图 DB51/T 2685 2020 5 9 样品处理及生物安全管控措施 实验完毕后，立即对实验室检测环境进行消毒，同时对样品及试验过程中产生的废弃物进行高温高 压灭菌处理，并送有资质的无害化处理公司进行处理。 DB51/T 2685 2020 6 A A 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 8mmol/L NaOH溶液 称量 0.32g NaOH，溶解到 1000 mL去离子水中，混匀，分装，常温保存。 A.2 磷酸盐缓冲液（ 0.01mol/L PBS， pH7.4） 用 800
15、mL蒸馏水溶解 8g NaCl， 0.2g KCl， 1.44g Na2HPO4和 0.24g KH2PO4。用 HCl调节溶液的 pH至 7.4， 加水至 1L。分装后经 121 、 15min高压灭菌后备用。 DB51/T 2685 2020 7 B B 附 录 B （规范性附录） 引物 表 B.1 引物的名称与序列 名称 序列 PRVgE p1 5- ACGAGCCCCGCTTCCA -3 PRVgE p2 5- CATGTCCGAGACCACGCGCGTCCACTCGCAGCTCTTCT -3 PRVgE p3 5-FAM-GCATCAGGTCGAACGTGT -3 PRVgE p4
16、5-Biotion-CATGTCCGAGACCACGCGCG -3 PRVgE p5 5- CCAGCGTGGCGGTAAAGTTCTC -3 PRVgE p6 5- CGCGGGTGGTAGATGCA -3 注： 引物和探针可由生物公司合成，用 TE溶液溶解并稀释至 100mol/L储存浓度， -20 保存备用，保存期为 1年； 根据需要配制成 40mol/L工作浓度， -20 保存供检测使用，如经常使用反复冻融，有效期为 3个月。 DB51/T 2685 2020 8 C C 附 录 C （规范性附录） CPA 反应体系 C.1 CPA反应体系 组分 1 个检测反应的加入量 10Thermopol* Buffer 2 L Bst 酶（ 8U/ L） 1 L dNTP（ 10 mmol/L） 0.8 L Mg2+（ 100 mmol/L） 0.6 L PRVgE p1（ 40mol/L） 0.1 L PRVgE p2（ 40mol/L） 0.25 L PRVgE p3（ 40mol/L） 0.25 L PRVgE p4（ 40mol/L） 0.25 L PRVgE p5（ 40mol/L） 0.25 L PRVgE p6（ 40mol/L） 0.1 L ddH2O 10.4 L 合计 16 L _
