1、ICS 65.020.30CCS B 41 DB42湖 北 省 地 方 标 准DB 42/T 1589 2020H7亚 型 禽 流 感 病 毒 竞 争 ELISA抗 体 检 测 方法 Competitive ELISA for detection of antibodies against H7 subtype avian influenzavirus 2020 -07- 07发 布 2020- 11-07实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T XXXXX2020 I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语
2、 与 定 义 .14 检 测 原 理 .15 检 测 条 件 .16 操 作 步 骤 .2 7 结 果 判 定 .2附 录 A（ 资 料 性 附 录 ） 酶 标 抗 体 的 制 备 .4附 录 B（ 资 料 性 附 录 ） 对 照 品 的 制 备 .7附 录 C（ 规 范 性 附 录 ） 试 剂 配 制 .8附 录 D（ 资 料 性 附 录 ） 样 品 处 理 注 意 事 项 . 9 DB42/T XXXXX2020 II 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 给 出 的 规则 起
3、 草 。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口 管 理 。本 文 件 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 、 武 汉 科 前 生 物 股 份 有 限 公 司 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 金 梅 林 、 范 俊 青 、 李 冉 、 董 俊 、 王 园 园 、 但 汉 并 、 吴 超 、 董 晓 辉 、 徐 高 原 。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821， 邮 箱 ：； 华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话
4、 ： 027-87282038， 邮 箱 ： 。 对 本 文 件的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286905， 邮 箱 ： 。 DB42/T XXXXX2020 III 引 言禽 流 感 （ avianinfluenza,AI） 是 由 甲 型 流 感 病 毒 感 染 引 起 的 禽 类 急 性 传 染 病 。 按 照 致 病 力 的 强 弱可 分 为 无 致 病 性 禽 流 感 、 低 致 病 性 禽 流 感 、 中 致 病 性 禽 流 感 和 高 致 病 性 禽 流 感 。 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 属 于高 致
5、 病 性 禽 流 感 ， OIE将 高 致 病 性 禽 流 感 列 为 必 须 上 报 的 传 染 病 ， 我 国 将 其 列 为 是 优 先 防 治 和 重 点 防 范的 人 兽 共 患 病 。目 前 ， 检 测 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 抗 体 的 经 典 方 法 是 血 凝 抑 制 （ HI） 试 验 ， 该 方 法 的 优 点 是 对 试 验 条 件要 求 低 ， 缺 点 是 ： 操 作 繁 琐 ， 实 验 结 果 重 复 性 差 ， 灵 敏 度 低 ， 凝 集 情 况 的 准 确 判 断 需 要 大 量 观 察 后 总 结经 验 ， 受 主 观 影 响 因 素 较 大 。 H7
6、亚 型 禽 流 感 病 毒 竞 争 ELISA抗 体 检 测 方 法 是 用 纯 化 的 病 毒 作 为 包 被 抗 原 ，包 被 酶 标 板 ， 同 时 加 入 待 检 血 清 和 抗 HA蛋 白 单 克 隆 抗 体 的 酶 标 记 物 ， 使 血 清 中 的 抗 体 与 单 抗 竞 争 包 被 板上 的 抗 原 表 位 ， 从 而 判 断 血 清 中 是 否 含 有 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 抗 体 的 一 种 方 法 ， 是 一 种 操 作 简 便 、 检 出 率 高 、 敏 感 性 高 、 特 异 性 强 的 方 法 ， 且 能 实 现 高 通 量 检 测 和 标 准 化 ， 结
7、 果 更 客 观 ， 判 定 方 便 、 直 观 、 快 速准 确 。 DB42/T XXXXX2020 1 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 竞 争 ELISA抗 体 检 测 方 法1 范 围本 文 件 规 定 了 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 竞 争 ELISA抗 体 检 测 的 术 语 与 定 义 、 检 测 原 理 、 检 测 条 件 、 操 作 步骤 、 结 果 判 定 。本 文 件 适 用 于 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 抗 体 的 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件本 文 件 没 有 规 范 性 引 用 文 件 。 3 术 语 与 定 义下 列 术 语 和 定 义 适
8、用 于 本 文 件 。3.1 辣 根 过 氧 化 物 酶 HRP（ horseradish peroxidase, HRP）通 常 来 源 于 辣 根 ， 因 此 称 辣 根 过 氧 化 物 酶 ， 是 临 床 检 验 试 剂 中 的 常 用 酶 。 该 产 品 不 但 广 泛 用 于 多 个生 化 检 测 项 目 ， 也 广 泛 运 用 于 免 疫 类 (ELISA)试 剂 盒 。4 检 测 原 理本 文 件 采 用 竞 争 酶 联 免 疫 吸 附 法 （ cELISA） 的 原 理 ， 待 检 血 清 中 的 抗 体 和 酶 标 抗 体 竞 争 与 固 相 抗 原 结 合 ， 如 检 血
9、清 中 抗 体 含 量 越 多 ， 则 与 固 相 抗 原 结 合 的 酶 标 抗 体 就 越 少 ， 经 底 物 催 化 后 显 色 越 浅 。 将 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 血 凝 抑 制 试 验 抗 原 吸 附 到 固 相 载 体 的 表 面 形 成 固 相 抗 原 ， 待 检 血 清 和 酶 标 抗 体 同 时 加 入包 被 板 ， 若 待 检 血 清 中 含 有 抗 体 ， 则 可 与 抗 原 相 结 合 ， 同 时 酶 标 抗 体 也 抗 原 的 结 合 量 减 少 ； 加 入 底 物 后 ，底 物 被 酶 标 抗 体 中 的 HRP催 化 成 为 有 色 产 物 ， 产 物
10、 的 量 与 待 检 血 清 中 抗 体 的 量 呈 负 相 关 ， 故 可 根 据 呈 色的 深 浅 进 行 定 性 分 析 。 由 于 酶 的 催 化 效 率 很 高 ， 间 接 地 放 大 了 免 疫 反 应 的 结 果 ， 使 检 测 方 法 具 有 良 好 的敏 感 性 。5 检 测 条 件5.1 仪 器 与 耗 材 级 生 物 安 全 柜 或 者 超 净 工 作 台 、 酶 标 仪 （ 配 制 450nm波 长 滤 光 片 ） 、 离 心 机 （ 4000r/min） 、 微 量可 调 移 液 器 （ 200L、 1 mL） 、 枪 头 （ 200L、 1mL） 、 恒 温 箱 （
11、 37 ） 、 电 子 天 平 （ 0.01g-300g） 、 聚 苯 乙 烯 微 量 反 应 板 （ 96孔 ） 、 离 心 管 （ 1.5mL、 2mL、 5mL） 。5.2 试 剂 DB42/T XXXXX2020 2 HRP标 的 记 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 、 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 血 凝 抑 制 试 验 抗 原 、 底 物 液 、 终 止 液 、包 被 液 、 封 闭 液 、 20倍 浓 缩 洗 涤 液 、 样 品 稀 释 液 、 阴 性 对 照 品 、 阳 性 对 照 品 。H7亚 型 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备 、
12、纯 化 及 HRP标 记 方 法 见 附 录 A。阴 性 对 照 品 、 阳 性 对 照 品 的 制 备 方 法 见 附 录 B。试 剂 配 制 方 法 见 附 录 C。6 操 作 步 骤6.1 样 品 处 理取 动 物 全 血 ， 待 血 液 充 分 凝 固 后 ， 4000r/min离 心 10min， 收 集 上 清 。 要 求 血 清 清 亮 ， 无 溶 血 。 样 品处 理 过 程 中 应 防 止 样 品 的 污 染 ， 注 意 个 人 安 全 防 护 ， 具 体 注 意 事 项 见 附 录 D。6.2 抗 原 包 被 板 的 制 备 6.2.1 包 被用 包 被 液 将 H7亚 型
13、 禽 流 感 病 毒 血 凝 抑 制 试 验 抗 原 稀 释 至 工 作 浓 度 （ 0.2g/mL） 加 至 酶 标 板 孔 中 ， 每孔 100L， 在 2 8 放 置 15h。6.2.2 封 闭弃 去 包 被 液 ， 每 孔 加 入 封 闭 液 200L， 置 37 孵 育 2h； 弃 去 封 闭 液 ， 拍 干 ， 再 置 37 干 燥 2h。6.3 洗 涤 液 的 配 制使 用 前 ， 将 20倍 浓 缩 洗 涤 液 恢 复 至 室 温 （ 22-25 ） 并 摇 动 使 沉 淀 溶 解 ， 按 照 50mL20倍 浓 缩 洗 涤 液加 入 950mL去 离 子 水 的 比 例 稀
14、释 ， 稀 释 好 的 洗 涤 液 在 2-8 保 存 ， 有 效 期 为 7日 。6.4 洗 涤 弃 去 孔 中 液 体 ， 每 孔 加 入 配 制 好 的 洗 涤 液 200L， 弃 去 孔 中 液 体 。 洗 涤 4次 ， 最 后 一 次 在 吸 水 纸 上 拍干 。6.5 待 检 血 清 的 稀 释待 检 血 清 在 血 清 稀 释 板 中 按 10倍 稀 释 。 例 如 10L血 清 加 入 到 90L样 品 稀 释 液 中 ， 混 匀 备 用 。6.6 加 入 待 检 样 品 和 酶 标 记 物取 制 备 好 的 抗 原 包 被 板 ， 用 配 制 的 洗 涤 液 洗 涤 抗 原
15、包 被 板 1次 ， 将 稀 释 好 的 待 检 血 清 、 阴 性 对 照 和阳 性 对 照 各 取 50L加 至 抗 原 包 被 板 中 ， 待 检 血 清 各 设 1孔 ， 阴 、 阳 性 对 照 各 设 2孔 ， 同 时 加 入 酶 标 记 物50L。 轻 轻 振 匀 孔 中 样 品 ， 置 37 下 温 育 45min。 洗 涤 4次 ， 最 后 一 次 在 吸 水 纸 上 拍 干 。6.7 显 色 和 终 止 反 应每 孔 加 入 底 物 液 100L， 置 20 25 下 避 光 显 色 15min。 每 孔 加 终 止 液 50L。 10min内 在 酶 标 仪 上 测 定 4
16、50nm波 长 处 的 吸 光 度 （ OD值 ） 。7 结 果 判 定 DB42/T XXXXX2020 3 7.1 试 验 成 立 条 件阴 性 对 照 的 平 均 OD450nm值 1.0， 阳 性 对 照 的 抑 制 率 （ PI值 ） 50%。7.2 结 果 计 算PI值 按 式 （ 1） 确 定 ： %1001 NSPI值 （ 1）式 中 ：PI样 品 的 抑 制 率 ；S样 品 孔 OD 450nm值 ；N阴 性 对 照 孔 平 均 OD450nm值 。7.3 结 果 判 定被 检 样 品 的 PI值 40%， 该 样 品 判 为 阴 性 ； 被 检 样 品 的 PI值 40%，
17、 该 样 品 判 为 阳 性 。 DB42/T XXXXX2020 4 AA附 录 A（ 资 料 性 ）酶 标 抗 体 的 制 备A.1 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备A.1.1 免 疫 原 在 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 血 凝 抑 制 试 验 抗 原 中 加 入 pH值 7.4 的 PBS 2mL溶 解 ， 重 悬 后 的 溶液 加 入 等 体 积 饱 和 硫 酸 铵 搅 匀 ， 置 2 8 作 用 15h后 ， 2 8 8000r/min 离 心 40min， 收 集 沉 淀 物 加入 原 病 毒 液 1/20 体 积 的 生 理 盐 水 溶 解 ，
18、装 透 析 袋 内 ， 用 PBS透 析 15h除 盐 。 测 定 浓 缩 抗 原 液 的 蛋 白 含量 ， 加 入 终 浓 度 为 0.04 硫 柳 汞 钠 ， 并 调 整 病 毒 液 的 蛋 白 浓 度 至 20.05mg/mL， 同 时 用 HA 试 验 检 测 该 病 毒 液 的 效 价 ， 当 其 HA效 价 28即 可 作 为 免 疫 原 。A.1.2 小 鼠 免 疫 首 次 免 疫 取 免 疫 原 与 弗 氏 完 全 佐 剂 按 照 体 积 1:1进 行 乳 化 ， 6 8周 龄 雌 性 BALB/c 小鼠 3只 ， 皮 下 分 点 注 射 200g/只 ， 每 个 点 约 注
19、射 20g。 以 后 每 间 隔 2周 免 疫 一 次 ， 第 二 、 三 次 免 疫 将免 疫 原 与 弗 氏 不 完 全 佐 剂 乳 化 ， 皮 下 分 点 注 射 100g/只 。 第 三 次 免 疫 后 一 周 后 ， 自 小 鼠 尾 静 脉 采 血 用ELISA 法 检 测 血 清 抗 体 效 价 ， 选 择 效 价 高 的 小 鼠 在 融 合 前 3天 腹 腔 注 射 抗 原 （ 不 含 佐 剂 ） 约 200g进 行加 强 免 疫 。A.1.3 骨 髓 瘤 细 胞 的 培 养 融 合 前 一 周 复 苏 SP2/0 骨 髓 瘤 细 胞 ， 培 养 在 含 20%胎 牛 血 清 的
20、 RPMI1640培 养基 中 。 选 择 处 于 对 数 生 长 期 的 SP2/0， 以 RPMI1640培 养 基 洗 涤 两 次 后 ， 用 约 10mL RPMI1640培 养 基 将其 吹 下 。 收 集 于 50mL离 心 管 ， 1000r/min离 心 5min， 弃 上 清 液 ， 轻 轻 敲 打 管 底 使 细 胞 松 散 ， 加 入 10mLRPMI1640培 养 基 重 悬 细 胞 。 将 细 胞 悬 液 10倍 稀 释 后 计 数 ， 准 备 融 合 。A.1.4 免 疫 脾 细 胞 的 制 备 取 加 强 免 疫 4 天 后 的 小 鼠 ， 摘 取 眼 球 眼 眶
21、 放 血 ， 获 得 阳 性 血 清 ， 脱 颈 处 死 ，置 于 75%的 酒 精 中 浸 泡 10min， 无 菌 取 出 脾 脏 ， 先 用 RPMI1640培 养 基 洗 涤 数 次 ， 去 除 附 着 的 结 缔 组 织 ；再 将 脾 脏 移 入 另 一 置 有 300目 微 孔 滤 网 的 新 鲜 RPMI1640培 养 基 中 ， 眼 科 剪 刀 剪 开 一 个 小 口 ， 用 研 磨 棒 轻 轻 挤 压 ， 释 放 脾 细 胞 ， 制 成 脾 细 胞 悬 液 ， 移 至 10mL离 心 管 中 ， 置 37 ， 含 5%二 氧 化 碳 的 培 养 箱 内 自然 沉 降 10mi
22、n， 吸 取 上 层 细 胞 悬 液 于 50 mL离 心 管 中 ， 再 加 入 3mL RPMI1640培 养 基 重 复 洗 涤 2 次 。 以1000r/min 离 心 10min， 弃 上 清 液 。 加 入 10mLRPMI1640培 养 基 重 悬 细 胞 。 将 细 胞 悬 液 10 倍 稀 释 后 计 数 。A.1.5 饲 养 细 胞 的 制 备 取 空 白 BALB/c 小 鼠 一 只 ， 摘 取 眼 球 眼 眶 放 血 ， 获 得 阴 性 血 清 ， 脱 颈 处 死 ， 置 于75%的 酒 精 中 浸 泡 10min， 无 菌 取 出 脾 脏 ， 先 用 RPMI1640
23、培 养 基 洗 涤 2 次 ， 去 除 附 着 的 结 缔 组 织 ； 再 将脾 脏 移 入 另 一 置 有 200目 微 孔 滤 网 的 RPMI1640培 养 基 中 ， 眼 科 剪 刀 剪 开 一 个 小 口 ， 用 研 磨 棒 轻 轻 挤 压 ，释 放 脾 细 胞 ， 制 成 脾 细 胞 悬 液 ， 移 至 10mL 离 心 管 中 ， 置 37 ， 含 5%二 氧 化 碳 的 培 养 箱 内 自 然 沉 降 10min，吸 取 上 层 细 胞 悬 液 于 50mL 离 心 管 中 ， 再 加 入 3mL RPMI1640培 养 基 重 复 洗 涤 2次 。 以 1000r/min离
24、心10min， 弃 上 清 液 。 加 入 10 mL RPMI1640培 养 基 重 悬 细 胞 。A.1.6 细 胞 融 合 将 一 瓶 含 20%胎 牛 血 清 、 1%HAT 的 RPMI1640培 养 基 、 1mL 50% PEG1450、 放 入 37 温箱 中 预 热 。 将 重 悬 后 的 免 疫 脾 细 胞 与 骨 髓 瘤 细 胞 在 50 mL 离 心 管 中 混 匀 ， 1000r/min 离 心 10min， 弃 去上 清 液 ， 用 滤 纸 将 管 壁 上 残 留 的 液 体 吸 干 ， 用 手 指 尖 轻 轻 弹 管 底 ， 使 两 种 细 胞 充 分 混 匀 ，
25、 将 离 心 管 置 于37 水 浴 中 ； 吸 取 预 热 的 PEG溶 液 0.8mL， 向 细 胞 沉 淀 缓 缓 滴 加 ， 边 滴 边 轻 轻 搅 拌 ， 在 1min内 加 完 。 静 置 30 秒 ， 之 后 3min内 加 入 预 热 的 RPMI1640 培 养 基 3mL， 终 止 PEG 的 作 用 。 余 下 的 17mL培 养 基 在 2min内 加 完 。 融 合 完 成 后 ， 1000r/min 离 心 10min， 弃 上 清 液 。 将 沉 淀 的 细 胞 轻 轻 悬 浮 于 20%胎 牛 血 清 、 1%HAT的 RPMI1640 培 养 基 中 ， 加
26、入 适 量 的 饲 养 细 胞 后 ， 置 于 96 孔 细 胞 培 养 板 中 ， 约 200L/孔 ， 置 37 ， 含5%二 氧 化 碳 的 培 养 箱 内 培 养 。 第 五 天 补 加 1 滴 HAT培 养 基 ， 第 8天 弃 去 孔 中 液 体 ， 补 加 200L HAT培 养基 ， 待 融 合 集 落 长 至 孔 底 面 积 的 1/4时 ， 取 上 清 进 行 抗 体 检 测 。 DB42/T XXXXX2020 5 A.1.7 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 筛 选 用 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 HI 试 验 筛 选 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 。 将 细 胞 上 清
27、作 为 待 检样 品 加 入 反 应 板 中 ， 同 时 设 定 SP2/0细 胞 培 养 上 清 作 为 阴 性 对 照 ， 免 疫 小 鼠 血 清 做 为 阳 性 对 照 。A.1.8 有 竞 争 效 果 的 细 胞 株 的 筛 选 用 禽 流 感 病 毒 H7 亚 型 HI试 验 筛 选 出 阳 性 血 清 1 份 ， 阴 性 血 清 1 份 。将 筛 选 出 的 阳 性 血 清 和 阴 性 血 清 用 样 品 稀 释 液 2 倍 稀 释 ， 加 入 包 被 好 的 酶 标 板 中 ， 100L/孔 ， 37 作 用30min。 弃 去 孔 中 液 体 ， 洗 涤 5 次 ， 拍 干 ，
28、 分 别 加 入 阳 性 细 胞 上 清 各 100L， 37 作 用 30min。 洗 涤 5次 ， 拍 干 ， 加 入 1:5000稀 释 的 羊 抗 鼠 IgG-HRP， 每 孔 加 入 100L， 37 作 用 30min。 洗 涤 5 次 ， 拍 干 ，每 孔 加 底 物 显 色 液 100L， 室 温 显 色 15min。 每 孔 加 入 50L 终 止 液 ， 用 酶 标 仪 进 行 测 定 各 孔 OD450nm值 。A.1.9 杂 交 瘤 细 胞 的 亚 克 隆 采 用 有 限 稀 释 法 对 连 续 3 次 检 测 均 为 阳 性 且 HI 抗 体 效 价 高 者 进 行
29、亚 克 隆 。首 先 制 备 小 鼠 饲 养 细 胞 ， 铺 于 96孔 细 胞 板 中 ， 100L/孔 ； 将 阳 性 孔 中 的 杂 交 瘤 细 胞 用 培 养 基 吹 下 ， 细胞 计 数 ， 用 有 限 稀 释 法 按 照 5:3:1 的 比 例 加 入 96 孔 板 ， 即 96 孔 板 的 前 四 排 细 胞 数 为 5个 /孔 ， 中 间 四排 细 胞 数 为 3个 /孔 ， 最 后 四 排 细 胞 数 为 1 个 /孔 ， 加 完 后 置 37 ， 含 5%二 氧 化 碳 的 培 养 箱 内 培 养 ， 第七 日 用 新 的 培 养 基 置 换 出 96孔 板 中 培 养 基
30、 ， 以 后 每 天 观 察 ， 待 上 清 变 黄 对 出 现 单 个 细 胞 克 隆 孔 用 ELISA 方 法 进 行 检 测 ； 连 续 3次 亚 克 隆 且 检 测 阳 性 者 可 以 定 株 。 将 定 株 的 单 克 隆 细 胞 扩 大 至 24孔 板 ， 长 满 后转 至 6 孔 板 ， 最 后 扩 大 培 养 至 25cm2细 胞 培 养 瓶 中 ， 一 部 分 冻 存 ， 每 株 杂 交 瘤 细 胞 保 存 6 份 ； 一 部 分 扩大 培 养 用 于 制 备 腹 水 。A.1.10 腹 水 法 制 备 单 克 隆 抗 体 选 用 8 10 周 龄 BALB/c雌 性 小
31、鼠 ， 腹 腔 注 射 灭 菌 液 体 石 蜡 ， 0.5mL/只 ；1 周 后 腹 腔 注 射 用 PBS稀 释 的 处 于 对 数 生 长 期 的 杂 交 瘤 细 胞 ， 1105个 /只 ； 7 10日 后 采 集 腹 水 ，1200r/min 离 心 10min， 去 除 脂 肪 组 织 ， 吸 取 上 清 ， -70 及 以 下 保 存 备 用 。A.2 单 克 隆 抗 体 的 纯 化 及 验 证A.2.1 腹 水 单 克 隆 抗 体 的 纯 化将 上 述 腹 水 取 1mL， 加 入 4mLpH值 4.5醋 酸 缓 冲 液 ， 加 入 辛 酸 25L， 搅 拌 30min， 静 置
32、 2h。 12000r/min离 心 10min； 弃 沉 淀 ， 上 清 用 滤 纸 过 滤 后 将 pH值 调 至 7.4， 缓 慢 逐 滴 加 入 上 述 液 体 体 积 45%的 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 ， 继 续 搅 拌 30min， 在 2 8 静 置 2h； 以 12000r/min离 心 30min， 弃 上 清 。 用 原 腹 水 1/2体 积 的 10mmol/LTris-HCL（ pH值 9.0） 将 沉 淀 重 悬 ， 转 入 透 析 袋 中 ， 在 10mmol/LTris-HCL（ pH值 9.0） 中 2 8 透 析 15h。超 微 量 核 酸 蛋 白 测 定
33、 仪 测 定 单 克 隆 抗 体 浓 度 ， 分 装 ， -70 及 以 下 保 存 。A.2.2 单 克 隆 抗 体 的 鉴 定A.2.2.1 浓 度 将 纯 化 后 的 单 克 隆 抗 体 用 超 微 量 核 酸 蛋 白 测 定 仪 测 定 蛋 白 浓 度 ， 浓 度 为 4.2mg/mL。A.2.2.2 纯 度 用 SDS-PAGE电 泳 检 测 单 抗 纯 度 ， 结 果 见 图 A.1。 电 泳 显 示 结 果 应 为 两 条 清 晰 的 目 的 条 带 ，即 在 50KD和 25KD附 近 各 有 一 条 清 晰 的 目 的 条 带 ， 分 别 为 重 链 和 轻 链 ， 无 其
34、他 杂 带 。 DB42/T XXXXX2020 6 图 A.1 单 克 隆 抗 体 的 纯 度 鉴 定A.2.3 酶 标 抗 体 的 制 备A.2.3.1 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ HRP） 标 记 单 克 隆 抗 体 用 过 碘 酸 盐 氧 化 法 标 记 单 克 隆 抗 体 ， 步 骤 如 下 ： 称 取5mg 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ HRP） 溶 于 l mL双 蒸 水 中 ， 加 入 500L新 鲜 配 制 的 0.06 mol/L的 NaIO4， 2 8反 应 30min， 溶 液 呈 草 绿 色 ， 再 加 入 0.5mL乙 二 醇 （ 0.16mol/L） ， 混
35、 匀 后 室 温 避 光 反 应 30min。 然 后 加 入 5mg纯 化 的 单 克 隆 抗 体 ， 在 0.05mol/L pH值 9.5的 碳 酸 盐 缓 冲 液 中 2 8 透 析 15h。 次 日 ， 在 溶 液 中 加 入 5mg/mL新 鲜 配 制 的 NaBH 4 0.2mL， 混 匀 后 2 8 反 应 2h， 再 加 入 等 体 积 的 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 ， 2 8 静置 30min， 7000r/min离 心 10min， 弃 上 清 ， 用 PB重 悬 ， 在 PB中 2 8 透 析 15h。 收 集 透 析 袋 内 容 物 ， 调整 酶 标 记 物 浓 度
36、 为 40.05mg/mL， 加 入 等 体 积 甘 油 作 为 酶 标 记 物 贮 备 液 ， 分 装 1mL/管 ， -70 及 以 下 保 存备 用 。A.2.3.2 酶 标 抗 体 的 制 备 用 保 护 剂 将 酶 标 记 物 贮 备 液 稀 释 1000倍 ， 用 0.22m滤 膜 过 滤 除 菌 ， 即 为 酶 标抗 体 。 DB42/T XXXXX2020 7 BB附 录 B（ 资 料 性 ）对 照 品 的 制 备B.1 阴 性 对 照 品 的 制 备 及 检 验B.1.1 阴 性 对 照 品 的 制 备B.1.1.1 制 造 用 动 物 为 40日 龄 SPF鸡 。B.1.1
37、.2 阴 性 血 清 的 制 备 选 用 40日 龄 SPF鸡 ， 用 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 HI试 验 检 测 免 疫 前 血 清 ， 其 HI抗 体 效 价 应 低 于 2log2。 将 检 测 HI抗 体 效 价 2log2的 鸡 进 行 颈 动 脉 采 血 ， 待 血 液 充 分 凝 固 后 ， 4000r/min离 心 10min， 分 离 血 清 ， 并 加 入 终 浓 度 为 0.04 硫 柳 汞 钠 防 腐 ， -70 及 以 下 长 期 保 存 。B.1.1.3 阴 性 对 照 品 的 配 制 将 制 备 的 阴 性 血 清 用 保 护 剂 稀 释 4倍 ， 用 0
38、.22m滤 膜 过 滤 除 菌 ， 即 为 阴 性对 照 品 。B.1.2 阴 性 对 照 品 的 检 验B.1.2.1 性 状 检 验 澄 清 液 体 ， 有 时 有 少 量 悬 浮 物 。B.1.2.2 无 菌 检 验 按 现 行 中 国 兽 药 典 附 录 进 行 检 验 ， 无 菌 生 长 。B.1.2.3 HI抗 体 效 价 检 验 用 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 HI试 验 检 将 阴 性 对 照 品 进 行 效 价 检 测 （ 设 8孔 重 复 ） ， HI抗 体 效 价 均 2log 2。B.2 阳 性 对 照 品 的 制 备 及 检 验B.2.1 阳 性 对 照 品 的
39、制 备B.2.1.1 制 造 用 动 物 选 用 20日 龄 SPF鸡 ， 免 疫 前 检 测 血 清 中 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 抗 体 HI抗 体 效 价 应 低 于 2log2。B.2.1.2 免 疫 方 法 首 次 免 疫 取 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 血 凝 抑 制 试 验 抗 原 与 弗 氏 完 全 佐 剂 按 照 体 积 1:1进 行乳 化 ， 通 过 腿 部 肌 肉 注 射 ， 接 种 量 0.5mL/羽 。 第 二 、 三 次 免 疫 将 免 疫 原 与 弗 氏 不 完 全 佐 剂 乳 化 ， 通 过 腿部 肌 肉 注 射 ， 接 种 量 0.5mL/羽 ， 每
40、 次 间 隔 14日 。B.2.1.3 血 清 采 集 及 处 理 第 三 次 免 疫 后 7日 采 血 ， 分 离 血 清 ， 用 HI试 验 检 测 血 清 效 价 ， 当 血 清 HI抗 体 效价 8log 2时 ， 采 血 。 待 血 液 充 分 凝 固 后 ， 4000r/min离 心 10min分 离 血 清 ， 并 加 入 终 浓 度 为 0.04 硫 柳 汞钠 防 腐 ， -70 及 下 长 期 保 存 。B.2.1.4 阳 性 对 照 品 的 配 制 使 用 前 将 制 备 的 阳 性 血 清 用 保 护 剂 稀 释 4倍 ， 用 0.22m滤 膜 过 滤 除 菌 ， 即为
41、阳 性 对 照 品 。B.2.2 阳 性 对 照 品 的 检 验B.2.2.1 性 状 检 验 澄 清 液 体 ， 有 时 有 少 量 悬 浮 物 。B.2.2.2 无 菌 检 验 按 现 行 中 国 兽 药 典 附 录 进 行 检 验 ， 无 菌 生 长 。B.2.2.3 HI抗 体 效 价 检 验 将 阳 性 对 照 品 用 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 血 凝 抑 制 试 验 抗 原 进 行 HI试 验 ， 重 复 8孔 ，检 测 其 效 价 ， 均 6log 2。 DB42/T XXXXX2020 8 CC附 录 C（ 规 范 性 ）试 剂 配 制C.1 包 被 液碳 酸 钠 （ N
42、a 2CO3） 1.59g， 碳 酸 氢 钠 （ NaHCO3） 2.93g， 加 蒸 馏 水 至 1000mL。C.2 封 闭 液牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 5g， 氯 化 钠 （ NaCl） 8g， 氯 化 钾 （ KCl） 0.2g， 十 二 水 磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO4）2.9g， 磷 酸 二 氢 钾 （ KH2PO4） 0.2g， 硫 柳 汞 钠 0.2g， 加 蒸 馏 水 至 1000mL。C.3 洗 涤 液氯 化 钠 （ NaCl） 8g， 氯 化 钾 （ KCl） 0.2g， 十 二 水 磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO4） 2.9g， 磷 酸 二
43、 氢 钾 （ KH2PO4）0.2g， Tween-20 0.5mL， 加 蒸 馏 水 至 1000mL。C.4 底 物 液商 品 化 TMB显 色 液 。C.5 终 止 液浓 硫 酸 27.2mL， 加 蒸 馏 水 至 1000mL。C.6 样 品 稀 释 液 氯 化 钠 （ NaCl） 8g， 氯 化 钾 （ KCl） 0.2g， 十 二 水 磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO4） 2.9g， 磷 酸 二 氢 钾 （ KH2PO4）0.2g， 加 蒸 馏 水 至 1000mL。 DB42/T XXXXX2020 9 DD附 录 D（ 资 料 性 ）样 品 处 理 注 意 事 项D.1 防 止 样 品 和 环 境 污 染 措 施D.1.1 血 液 中 血 清 析 出 后 ， 应 在 级 生 物 安 全 柜 或 超 净 工 作 台 中 吸 出 。D.1.2 样 品 处 理 与 ELISA 检 测 应 在 不 同 的 区 域 进 行 。 ELISA可 在 敞 开 干 净 的 空 间 内 进 行 。 操 作 区 应 有专 门 的 固 体 和 液 体 废 弃 物 收 集 容 器 。D.1.3 废 弃 物 经 高 压 灭 菌 后 应 按 相 关 规 定 处 理 。 D.2 个 人 防 护 措
