1、ICS 65.020.30CCS B 41 DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 1592 2020鸭 坦 布 苏 病 毒 双 抗 夹 心 ELISA抗 原 检 测规 程 TechnicalproceduresofthedoubleantibodysandwichELISAassaysfordetectionofducktembusuvirus（ 报 批 稿 ） 2020 -07- 07发 布 2020- 11-07实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T XXXX-XXXX I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文
2、 件 .13 术 语 和 定 义 .14 试 剂 和 材 料 .15 抗 体 包 被 板 的 制 备 .26 待 检 样 品 处 理 .2 7 检 测 步 骤 .28 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施 .2附 录 A（ 资 料 性 ） 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备 .4附 录 B（ 资 料 性 ） 对 照 品 的 制 备 .8附 录 C（ 规 范 性 ） 试 剂 的 配 制 .10 DB42/T XXXX-XXXX II 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构
3、 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口 。本 文 件 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 、 武 汉 科 前 生 物 股 份 有 限 公 司 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 金 梅 林 、 孙 小 云 、 陈 伦 勇 、 张 雪 、 孙 小 美 、 但 汉 并 、 赵 联 忠 、 李 冉 、 董 晓 辉 、徐 高 原 。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821， 邮 箱 ：
4、； 华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话 ： 027-87282038， 邮 箱 ： 。 对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286905， 邮 箱 ：。 DB42/T XXXX-XXXX III 引 言鸭 坦 布 苏 病 毒 病 （ Duck Tembusu Virus Disease） 是 主 要 引 起 蛋 鸭 产 蛋 量 急 剧 下 降 的 一 种 疾 病 ， 严重 的 则 会 出 现 绝 产 。 该 病 传 播 极 为 迅 速 ， 短 时 间 内 波 及 全 群 ， 发 病 率 高 达 100%
5、， 死 亡 淘 汰 率 则 根 据 不 同的 品 种 在 2%-55%之 间 。 在 2011年 召 开 的 第 一 届 水 禽 疫 病 防 控 研 讨 会 期 间 ， 中 国 畜 牧 兽 医 学 会 将 该 传 染病 正 式 统 一 命 名 ， 称 为 “鸭 坦 布 苏 病 毒 病 ”。鸭 坦 布 苏 病 毒 病 的 疾 病 传 播 特 点 和 危 害 使 得 病 原 的 监 测 和 检 测 成 为 各 地 疫 控 部 门 和 各 个 规 模 化 养殖 场 的 重 要 工 作 之 一 。 DB42/T XXXX-XXXX 1 鸭 坦 布 苏 病 毒 双 抗 夹 心 ELISA 抗 原 检 测
6、 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 鸭 坦 布 苏 病 毒 双 抗 夹 心 ELISA抗 原 检 测 的 术 语 和 定 义 、 试 剂 和 材 料 、 抗 体 包 被 板 的 制备 、 待 检 样 品 处 理 、 检 测 步 骤 、 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施 。本 文 件 适 用 于 鸭 坦 布 苏 病 毒 病 原 的 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版
7、 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB/T 6682-2008 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 。3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 鸭 坦 布 苏 病 毒 Tembusu virus鸭 坦 布 苏 病 毒 是 一 种 急 性 传 染 病 ， 以 蛋 鸭 、 种 鸭 产 蛋 骤 然 下 降 为 主 要 临 床 特 征 、 以 出 血 性 卵 巢 炎 为主 要 病 变 特 征 。3.2 酶 联 免 疫
8、 吸 附 法 Enzyme-linkedimmune sorbentassay酶 联 免 疫 吸 附 法 是 将 抗 原 抗 体 反 应 的 高 度 特 异 性 与 酶 标 记 技 术 相 结 合 ， 将 已 知 的 抗 原 或 抗 体 标 记 上 酶 示 踪 物 质 ， 利 用 酶 对 底 物 的 高 效 催 化 作 用 ， 通 过 酶 标 仪 测 定 酶 分 解 底 物 产 生 的 有 色 物 质 的 光 密 度 值 ，计 算 抗 原 或 抗 体 的 含 量 。3.3 630nm吸 光 度 值 Optical density at 630nmOD 值 表 示 被 检 测 物 吸 收 掉 的
9、 光 密 度 ， 是 检 测 方 法 里 的 专 有 名 词 ， 检 测 单 位 用 OD 值 表 示 ，OD=lg(1/trans)， 其 中 trans为 检 测 物 的 透 光 值 ,因 此 又 叫 通 光 率 。 630nm 吸 光 度 值 即 为 在 630nm 的 波 长下 测 OD值 。4 试 剂 和 材 料4.1 试 剂鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 、 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 、 TMB底 物 显 色 液 、 终 止 液 、 阳 性 对 照 品 、 阴 性 对 照 品 、 样 品 稀 释 液 、 20倍 浓
10、缩 洗 涤 液 、 碳 酸 盐 包 被 液 、 封 闭 液 。鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 制 备 、 纯 化 及 HRP标 记 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 制 备 方 法 见 附 录 A。 DB42/T XXXX-XXXX 2 阳 性 对 照 品 、 阴 性 对 照 品 的 制 备 方 法 见 附 录 B。试 剂 配 方 见 附 录 C。4.2 仪 器 设 备 及 耗 材离 心 机 （ 12000rpm） 、 恒 温 箱 （ 37 ） 、 聚 苯 乙 烯 微 量 反 应 板 （ 96孔 ） 、 酶 标 仪 （ 630nm波 长 ） 、 多道 移 液 器 （ 30
11、0L） 、 单 道 移 液 器 （ 100L、 1mL） 。5 抗 体 包 被 板 的 制 备5.1 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 包 被将 纯 化 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 用 碳 酸 盐 包 被 液 稀 释 至 5.98ng/L， 每 孔 加 100L， 置 于 2 8冰 箱 静 置 12h 15h。 5.2 包 被 板 的 封 闭弃 净 包 被 板 中 所 有 的 液 体 ， 每 孔 加 入 封 闭 液 200L， 置 于 37 恒 温 箱 静 置 2h； 再 次 弃 净 包 被 板 中 所有 的 液 体 ， 将 包 被 板 静 置 于 37 恒
12、温 箱 2h。6 待 检 样 品 处 理6.1 拭 子 样 品 的 处 理在 装 有 拭 子 的 离 心 管 中 ， 加 入 500L样 品 稀 释 液 ， 充 分 振 荡 涡 旋 后 ， 10000rpm离 心 3min， 弃 沉 淀 ，取 100L上 清 进 行 检 测 。6.2 组 织 样 品 的 处 理每 份 组 织 样 品 取 1g， 加 入 2mL样 品 稀 释 液 ， 研 磨 匀 浆 ， 12000rpm离 心 2min， 取 上 清 ， 再 次 12000rpm离 心 3min， 取 100L上 清 进 行 检 测 。7 检 测 步 骤7.1 取 制 备 好 的 抗 体 包 被
13、 板 ， 用 洗 涤 液 洗 涤 3 次 ， 弃 净 孔 中 液 体 ， 将 处 理 好 的 待 检 样 品 、 阴 性 对 照 和阳 性 对 照 各 取 100L加 至 抗 体 包 被 板 中 ， 阴 、 阳 性 对 照 各 设 2孔 ， 置 37 恒 温 箱 中 下 温 育 60min。7.2 弃 去 孔 中 液 体 ， 每 孔 加 入 洗 涤 液 300L/孔 ， 重 复 洗 涤 5 次 。7.3 将 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 用 封 闭 液 稀 释 到 工 作 浓 度 ， 100L/孔 ， 置 37恒 温 箱 中 温 育 60m
14、in。7.4 重 复 步 骤 7.2。7.5 每 个 反 应 孔 中 加 入 底 物 显 色 液 100L， 置 20 25 恒 温 箱 中 避 光 显 色 10min。7.6 每 孔 加 入 终 止 液 50L。7.7 用 酶 标 仪 在 波 长 630nm 处 测 定 各 孔 的 OD 值 。 7.8 检 验 结 果 的 判 定 ， 当 S（ 样 品 OD630nm） /N（ 阴 性 对 照 OD630nm） 2， 阴 性 对 照 OD630nm 0.25 时 试 验 成立 ， 样 品 检 测 结 果 判 为 阳 性 ； 当 S（ 样 品 OD630nm） /N（ 阴 性 对 照 OD63
15、0nm） 2， 阴 性 对 照 OD630nm 0.25时 ，样 品 检 测 结 果 判 为 阴 性 。 DB42/T XXXX-XXXX 3 8 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施8.1 试 验 完 毕 ， 酶 标 板 ， 移 液 器 吸 头 ， 样 品 处 理 时 使 用 过 的 离 心 管 等 耗 材 须 高 温 高 压 灭 菌 处 理 。8.2 试 验 过 程 中 丢 弃 的 废 液 须 加 入 84消 毒 液 或 新 洁 尔 灭 彻 底 消 毒 。 DB42/T XXXX-XXXX 4 附 录 A（ 资 料 性 ）鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备
16、A.1 鸭 坦 布 苏 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备A.1.1 免 疫 小 鼠用 超 离 纯 化 灭 活 的 鸭 坦 布 苏 全 病 毒 免 疫 6周 龄 -8周 龄 雌 性 BALB/c小 鼠 ， 免 疫 剂 量 为 100ng/只 。 取 适量 的 纯 化 病 毒 溶 液 用 PBS稀 释 后 加 入 等 体 积 的 弗 氏 完 全 佐 剂 充 分 乳 化 后 颈 背 部 皮 下 多 点 接 种 ， 每 只 接 种200 L。 首 免 两 周 后 再 次 免 疫 ， 剂 量 同 于 首 次 ， 与 弗 氏 不 完 全 佐 剂 体 积 比 1:1充 分 乳 化 后 接 种 ， 两
17、周 后 再 次 进 行 三 免 ， 免 疫 剂 量 及 佐 剂 的 选 择 同 于 第 二 次 免 疫 ， 三 免 后 一 周 尾 静 脉 采 全 血 5 L， 溶 于 200 L PBS中 ， 混 匀 ， 依 次 倍 比 稀 释 加 入 到 用 纯 化 的 DTMUV全 病 毒 液 包 被 的 酶 标 板 中 测 定 小 鼠 的 血 清 抗 体 效 价 ， 取效 价 最 高 的 小 鼠 ， 加 强 免 疫 ， 免 疫 剂 量 为 100ng， 不 加 佐 剂 ， 直 接 腹 腔 注 射 ， 72h后 进 行 融 合 试 验 。A.1.2 饲 养 脾 细 胞 及 免 疫 脾 细 胞 的 制 备
18、取 饲 养 小 鼠 及 免 疫 小 鼠 ， 分 别 摘 眼 球 采 血 ， 分 离 血 清 作 为 阴 /阳 性 血 清 备 用 。 拉 颈 致 死 后 浸 于 75%酒 精 浸 泡 10min。 将 小 鼠 腹 部 向 上 右 侧 位 卧 放 ， 用 消 毒 的 注 射 器 针 头 固 定 其 四 肢 。 小 心 打 开 其 腹 腔 ， 无菌 取 出 脾 脏 ， 置 于 研 磨 器 中 加 10mL RPMI 1640溶 液 研 磨 ， 静 置 2-3min后 吸 出 上 清 于 无 菌 50mL EP管 内 ，再 加 入 10mL1640研 磨 静 置 2min后 取 上 清 加 入 无
19、菌 EP管 内 ， 将 上 清 1000rpm离 心 10min， 去 除 上 清 获 得 饲 养脾 细 胞 和 免 疫 脾 细 胞 。 在 饲 养 细 胞 中 加 入 50mLHAT溶 液 ， 轻 轻 混 匀 ， 置 于 37 温 箱 。 在 免 疫 脾 细 胞 中 加入 50mLRPMI1640溶 液 ， 轻 轻 混 匀 。 将 瘤 细 胞 上 清 弃 去 ， 将 免 疫 脾 细 胞 溶 液 加 入 其 中 ， 轻 轻 混 匀 ， 1000rpm，离 心 10min， 去 除 上 清 。 A.1.3 融 合 试 验轻 轻 用 手 指 叩 击 装 有 免 疫 脾 细 胞 及 SP2/O细 胞
20、 的 EP管 底 ， 使 混 合 细 胞 松 动 ， 将 EP管 浸 入 37 温 水 中 ，用 巴 氏 管 吸 取 预 热 的 PEG1450溶 液 1mL， 边 轻 轻 搅 动 细 胞 边 滴 加 溶 液 ， 1min内 匀 速 加 完 ， 继 续 搅 30s， 静置 30s后 边 搅 拌 边 加 入 预 热 的 1640溶 液 ， 8min内 加 入 40mL 1640以 终 止 反 应 。 1000rpm10min， 去 除 上 清 ，加 入 50mL预 热 的 HAT溶 液 ， 轻 轻 混 匀 。 取 一 个 无 菌 试 剂 瓶 ， 将 饲 养 细 胞 和 融 合 细 胞 加 入 混
21、 匀 ， 分 铺 于 96孔 板 中 ， 每 孔 100 L， 每 孔 再 补 加 一 滴 完 全 培 养 基 ， 将 细 胞 板 置 于 37 CO2培 养 箱 中 静 置 培 养 。 每 天 观察 杂 交 瘤 细 胞 的 生 长 情 况 ， 在 融 合 后 第 5天 用 HAT培 养 基 进 行 半 换 液 ， 第 10天 用 HT培 养 基 将 HAT培 养 液 全部 换 出 ， 待 杂 交 瘤 细 胞 长 至 孔 底 的 1/3 1/2时 ， 取 100 L细 胞 上 清 进 行 检 测 。A.1.4 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 的 筛 选A.1.4.1 间 接 ELISA检 测 方
22、法 的 确 定用 方 阵 法 确 定 包 被 原 和 血 清 的 工 作 浓 度 。 取 超 离 纯 化 的 DTMUV全 病 毒 液 作 为 抗 原 ， 用 碳 酸 盐 包 被 液 按 1:50稀 释 ， 按 每 孔 100 L添 加 到 96孔 酶标 板 第 一 列 中 ， 提 前 在 每 孔 内 加 入 100 L包 被 液 ， 从 第 一 列 取 100 L稀 释 的 抗 原 加 入 到 第 二 列 ， 混 匀 后 DB42/T XXXX-XXXX 5 再 取 100 L至 第 三 列 ， 依 次 倍 比 稀 释 至 1:204800， 同 时 按 同 样 的 方 式 包 被 两 块
23、酶 标 板 ， 置 4 过 夜 。 次日 将 包 被 好 的 酶 标 板 用 PBS-T洗 涤 ， 每 孔 加 入 120 L白 保 护 剂 BSA封 闭 溶 液 ， 37 孵 育 2h， 进 行 封 闭 。 再次 洗 涤 拍 干 。 将 分 离 保 存 的 免 疫 小 鼠 和 饲 养 小 鼠 的 血 清 分 别 作 为 阳 性 和 阴 性 血 清 ， 用 PBS按 1:50倍 稀 释 ，第 一 行 每 孔 加 入 200 L， 余 孔 提 前 加 入 100 LPBS， 从 第 一 行 取 100 L到 第 二 行 开 始 倍 比 稀 释 至 1:6400，37度 孵 育 1h， 洗 板 后
24、 加 入 1:5000稀 释 的 HRP标 记 的 羊 抗 鼠 IgG， 37 孵 育 1h， 洗 板 后 加 入 TMB底 物 显 色 液 ，10min-15min后 加 入 2mol/L稀 H2SO4溶 液 终 止 反 应 。 读 取 OD630nm数 值 。 按 照 P/N值 最 大 原 则 ， 确 定 病 毒 液 的最 佳 包 被 浓 度 。A.1.4.2 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 的 筛 选按 方 阵 法 确 定 的 抗 原 包 被 浓 度 包 被 一 批 酶 标 板 ， 封 闭 处 理 后 4度 保 存 。 取 融 合 细 胞 上 清 100 L按 标记 好 的 顺 序 加 入
25、到 病 毒 和 空 白 辅 筛 酶 标 板 中 ， 按 间 接 ELISA方 法 进 行 检 测 ， 同 时 用 1.2中 饲 养 小 鼠 和 免 疫小 鼠 的 血 清 分 别 作 阴 阳 性 对 照 。 A.1.4.3 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 的 克 隆将 通 过 检 测 初 步 确 定 为 阳 性 的 杂 交 瘤 细 胞 采 用 倍 比 稀 释 法 进 行 亚 克 隆 。 轻 轻 吹 落 96孔 内 细 胞 ， 取100 L至 提 前 加 有 100 L完 全 培 养 基 的 细 胞 板 孔 内 ， 混 匀 ， 吸 取 100 L到 第 二 个 加 有 100 L完 全 培 养 基的
26、细 胞 板 孔 内 ， 依 次 倍 比 稀 释 到 第 八 个 孔 。 在 显 微 镜 下 观 察 ， 将 约 有 100个 细 胞 的 孔 内 细 胞 再 次 吸 出 用完 全 培 养 液 稀 释 至 10mL， 分 铺 于 一 块 提 前 铺 好 饲 养 细 胞 的 96孔 板 内 ， 每 孔 100 L， 37 CO2培 养 箱 内 静置 培 养 ， 此 过 程 称 之 为 亚 克 隆 。 将 倍 比 稀 释 最 后 一 孔 多 出 的 100 L及 96孔 板 剩 余 的 细 胞 移 取 至 加 有 饲 养细 胞 的 24孔 板 内 进 行 扩 大 培 养 。 亚 克 隆 细 胞 培
27、养 至 5天 左 右 进 行 半 换 液 ， 7天 左 右 进 行 全 换 液 ， 取 上 清 进行 检 测 ， 对 检 测 为 阳 性 的 细 胞 按 上 述 方 法 再 次 进 行 亚 克 隆 及 检 测 。 对 连 续 三 次 亚 克 检 测 为 阳 性 的 单 克 隆细 胞 进 行 定 株 ， 同 时 将 扩 大 培 养 的 原 代 细 胞 及 时 冻 存 。A.1.4.4 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 腹 水 的 制 备将 亚 克 隆 经 过 检 测 定 株 的 杂 交 瘤 细 胞 复 苏 ， 扩 大 培 养 。 提 前 一 周 用 弗 氏 不 完 全 佐 剂 腹 腔 注 射 8周 龄
28、 BALB/c小 鼠 ， 0.5mL/只 ， 将 扩 大 培 养 处 于 对 数 生 长 期 的 杂 交 瘤 细 胞 离 心 ， 去 掉 培 养 基 ， 用 RPMI1640不 完全 培 养 基 重 悬 后 腹 腔 注 射 小 鼠 。 待 小 鼠 腹 部 隆 起 时 ， 抽 取 其 腹 水 ， 离 心 ， 去 除 沉 淀 ， 上 清 冻 存 待 用 。A.2 单 克 隆 抗 体 纯 化 及 验 证A.2.1 单 克 隆 抗 体 纯 化将 保 存 的 单 抗 腹 水 6mL置 于 pH7.4 PBS溶 液 中 透 析 过 夜 ， 次 日 取 出 ， 加 入 6mL PBS混 匀 。 将 Prot
29、einA胶 吸 至 纯 化 柱 内 ， 将 柱 子 垂 直 固 定 ， 打 开 柱 子 下 方 盖 子 ， 待 液 体 流 尽 ， 加 入 20mL双 蒸 水 ， 待 水 流 尽 后 ，再 加 入 20mL PBS平 衡 柱 子 。 加 入 混 匀 的 腹 水 ， 封 闭 柱 子 ， 固 定 于 摇 床 上 轻 摇 30min。 打 开 柱 子 下 方 的 盖子 ， 放 出 柱 中 的 液 体 ， 加 入 20mL洗 脱 液 ， 取 10个 4mL EP管 ， 每 管 内 预 先 加 入 100 L1M Tris-Cl （ pH9.0） ，每 管 收 集 2mL， 混 匀 ， 4 暂 存 。
30、将 柱 子 用 单 蒸 水 洗 涤 后 ， 加 入 20%乙 醇 4 保 存 。 将 收 集 的 样 品 SDS-PAGE电 泳 分 析 其 纯 化 效 果 ， 见 图 1。 A.2.2 单 克 隆 抗 体 Western-Blot验 证将 超 离 纯 化 的 DTMUV全 病 毒 取 50 L加 上 12.5 L 5 SDS变 性 Buffer 95 加 热 5min， 进 行 SDS-PAGE，电 泳 完 毕 ， 取 出 凝 胶 ， 60v， 60min， 在 Tris-cl和 甲 醇 混 合 溶 液 中 转 至 PVDF膜 上 ， 转 化 完 毕 ， 将 膜 取 出 ，浸 泡 至 2%的
31、 BSA-PBS溶 液 ， 4 过 夜 放 置 。 次 日 取 出 ， 用 PBS-T洗 涤 三 次 ， 每 次 3min， 加 入 1:100稀 释 的 纯 DB42/T XXXX-XXXX 6 化 单 抗 ， 室 温 孵 育 1h， 洗 涤 三 次 ， 加 入 1:2000稀 释 的 HRP标 记 的 羊 抗 鼠 抗 体 溶 液 ， 室 温 孵 育 1h， 洗 涤 三次 ， DAB显 色 液 浸 泡 显 色 ， 用 单 蒸 水 终 止 反 应 ， 见 图 2。 注 ： 1,2,3,4泳 道 分 别 为 来 源 于 不 同 时 间 段 洗 脱 的 纯 化 产 物 。图 1 纯 化 的 5F1
32、小 鼠 单 抗 腹 水 SDS-PAGE电 泳 图 注 1： A： 全 病 毒 SDS-PAGE； 红 色 五 角 星 示 55kD处 E蛋 白 ；注 2： B： 全 病 毒 与 单 抗 WB图 ； 蓝 色 五 角 星 表 示 杂 交 所 示 的 70-100kD之 间 的 蛋 白 条 带 ；注 3： M： 蛋 白 marker； S： DTMUV全 病 毒 样 品 。图 2 超 离 纯 化 的 DTMUV全 病 毒 及 Western杂 交A.3 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 单 克 隆 抗 体称 取 10mg HRP粉 末 溶 于 1mL双 蒸 水 中 ， 溶 解 后 混 匀 ， 置
33、 于 50mL小 烧 杯 中 ， 加 入 1mL 0.06mol/L的 高 碘酸 钠 溶 液 ， 轻 轻 转 动 容 器 ， 混 匀 ， 4 放 置 30min。 往 上 述 溶 液 中 加 入 1mL 0.16mol/L乙 二 醇 ， 轻 轻 转 动容 器 ， 混 匀 ， 室 温 避 光 放 置 30min， 往 上 述 溶 液 中 加 入 10mg 11mg纯 化 的 单 抗 ， 轻 轻 转 动 混 匀 ， 将 所 有溶 液 装 入 透 析 袋 ， 置 于 碳 酸 盐 溶 液 中 ， 4 透 析 过 夜 ， 中 途 换 液 三 次 。 取 出 透 析 袋 中 液 体 ， 加 入 0.4mL
34、5mg/mL的 硼 氢 化 钠 溶 液 ， 4 静 置 2h。 往 上 述 溶 液 中 加 入 等 体 积 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 沉 淀 结 合 物 ， 缓 慢 滴 加 ， 同 时 在 磁 力 搅 拌 器 上 轻 轻 搅 拌 ， 加 完 后 轻 轻 转 动 混 匀 ， 4 静 置 30min后 4 3000rpm离 心 15min， 弃 上 清 。将 沉 淀 物 溶 于 适 量 的 0.02M的 PB溶 液 中 ， 装 入 透 析 袋 ， 置 于 PB中 平 衡 透 析 6h-12h， 中 途 换 液 三 次 ， 取 出透 析 袋 中 液 体 ， 加 入 等 体 积 甘 油 ， 分 装
35、， -80 冻 存 。 DB42/T XXXX-XXXX 7 A.4 纯 化 单 抗 及 酶 标 单 抗 的 蛋 白 浓 度 测 定以 最 终 稀 释 沉 淀 的 缓 冲 液 作 为 空 白 对 照 ， 用 NandropC 2000测 定 仪 测 定 浓 度 ， 根 据 ProteinA260/280软 件 分 别 测 定 纯 化 和 酶 标 单 抗 的 蛋 白 浓 度 。 纯 化 的 单 克 隆 抗 体 样 品 浓 度 为 2.392mg/mL， HRP标 记 的 单 克隆 抗 体 样 品 浓 度 为 2.56mg/mL。 DB42/T XXXX-XXXX 8 AA附 录 B（ 资 料 性
36、 ）对 照 品 的 制 备B.1 阴 性 对 照 品 的 制 备 及 检 验B.1.1 阴 性 对 照 品 的 制 备取 9日 10日 龄 SPF鸡 胚 ， 收 集 鸡 胚 尿 囊 液 ， 10000rpm离 心 5min 弃 去 沉 淀 ， 保 留 上 清 ， -20 条 件 下保 存 。 B.1.2 阴 性 对 照 品 的 检 验B.1.2.1 RNA的 提 取 及 反 转 录取 0.2mL 鸡 胚 尿 囊 液 ， 12000rpm， 3min， 将 上 清 移 入 2mL 无 RNA 酶 EP 管 内 ， 加 入 0.8mLTrizol试 剂 ， 轻 轻 混 匀 ， 室 温 静 置 10
37、min， 加 入 0.2mL 氯 仿 ， 剧 烈 振 摇 15s， 冰 浴 10min， 4 12000rpm 离心 15min， 将 上 清 移 入 新 的 EP 管 内 ， 加 入 等 体 积 异 丙 醇 ， 轻 轻 混 匀 ， 室 温 静 置 10min， 4 12000rpm离 心 10min， 弃 去 上 清 ， 在 EP 管 内 加 入 1mL 乙 醇 轻 轻 混 匀 ， 4 7500rpm 离 心 5min 弃 去 上 清 ， 室温 晾 干 ， 加 入 15 L DEPC 水 溶 解 ， 用 Nanodrop 浓 度 测 定 仪 测 定 其 浓 度 为 48.9ng/ L， -8
38、0 保 存 备用 。 提 取 的 RNA（ 12.5 L） 、 Oligo（ dT） （ 1 L） 、 AMV 反 转 录 酶 （ 0.5 L） 、 10*AMV buffer（ 2 L） 、RRI（ 1 L） 、 RNase-free-water （ 3 L） 将 上 述 各 试 剂 轻 轻 混 匀 （ 共 20 L） ， 42 1h， 72 15min取 出 ， 短 暂 离 心 后 4 保 存 。 B.1.2.2 PCR鉴 定根 据 GenBank 登 录 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 基 因 组 NS5基 因 设 计 一 对 特 异 性 引 物 ， 引 物 序 列 为 ：NS5-F:5-G
39、GGGAGGTGGTTTGGTTAG-3NS5-R:5-GTTCTGGGGCTTTGGTATC-3扩 增 片 段 大 小 为 498bp。PCR反 应 体 系 ： cDNA （ 2L） 、 10 Trans Buffer（ 2.5L） 、 TransTaq DNAPolymerase （ 0.5L） 、上 、 下 游 引 物 （ 各 1L） ， 补 H 2O至 25L。PCR反 应 程 序 ： 95 变 性 5min后 进 行 94 变 性 30s， 54 退 火 30s， 72 延 伸 30s的 32个 循 环 ， 最 后 72延 伸 10min， 保 存 于 4 ， 在 0.5%的 琼 脂
40、 糖 凝 胶 上 电 泳 ， 在 498bp处 应 无 目 的 条 带 。B.2 阳 性 对 照 品 的 制 备 及 检 验B.2.1 阴 性 对 照 品 的 制 备将 实 验 室 分 离 、 鉴 定 并 保 存 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 取 100L 接 种 9日 龄 10日 龄 SPF鸡 胚 ， 置 于 37 孵 化 箱内 孵 化 。 剔 除 24h之 内 的 死 亡 鸡 胚 ， 收 集 96h内 所 有 胚 的 尿 囊 液 ， 10000rpm离 心 5min弃 去 沉 淀 ， 保 留 上 清 ，-20 条 件 下 保 存 。 DB42/T XXXX-XXXX 9 B.2.2 阳 性
41、对 照 品 的 检 验B.2.2.1 RNA的 提 取 及 反 转 录取 0.2mL鸡 胚 尿 囊 液 ， 12000rpm， 3min， 将 上 清 移 入 2mL无 RNA酶 EP管 内 ， 加 入 0.8mLTrizol 试 剂 ，轻 轻 混 匀 ， 室 温 静 置 10min， 加 入 0.2mL氯 仿 ， 剧 烈 振 摇 15s， 冰 浴 10min， 4 12000rpm离 心 15min， 将上 清 移 入 新 的 EP管 内 ， 加 入 等 体 积 异 丙 醇 ， 轻 轻 混 匀 ， 室 温 静 置 10min， 4 12000rpm离 心 10min， 弃 去上 清 ， 在
42、EP管 内 加 入 1mL乙 醇 轻 轻 混 匀 ， 4 7500rpm离 心 5min弃 去 上 清 ， 室 温 晾 干 ， 加 入 15 L DEPC水 溶 解 ， 用 Nanodrop浓 度 测 定 仪 测 定 其 浓 度 为 48.9ng/ L， -80 保 存 备 用 。提 取 的 RNA （ 12.5 L） 、 Oligo（ dT） （ 1 L） 、 AMV 反 转 录 酶 （ 0.5 L） 、 10*AMV buffer（ 2 L） 、 RRI（ 1 L） 、 RNase-free-water（ 3 L） 将 上 述 各 试 剂 轻 轻 混 匀 （ 20 L） ， 42 1h，
43、7215min 取 出 ， 短 暂 离 心 后 4 保 存 。B.2.2.2 PCR鉴 定 根 据 GenBank登 录 的 鸭 坦 布 苏 病 毒 基 因 组 NS5基 因 设 计 一 对 特 异 性 引 物 ， 引 物 序 列 为 ：NS5-F:5-GGGGAGGTGGTTTGGTTAG-3NS5-R:5-GTTCTGGGGCTTTGGTATC-3扩 增 片 段 大 小 为 498bp。PCR反 应 体 系 ： cDNA 2L， 10 Trans Buffer 2.5L， TransTaq DNA Polymerase 0.5L， 上 、 下 游引 物 各 1L， 补 H2O至 25L。P
44、CR反 应 程 序 ： 95 变 性 5min后 进 行 94 变 性 30s， 54 退 火 30s， 72 延 伸 30s的 32个 循 环 ， 最 后 72延 伸 10min， 保 存 于 4 ， 在 0.5%的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 ， 在 498bp处 应 有 目 的 条 带 。 DB42/T XXXX-XXXX 10 BB附 录 C（ 规 范 性 ）试 剂 的 配 制C.1 包 被 液碳 酸 钠 （ Na 2CO3） 1.59g， 碳 酸 氢 钠 （ NaHCO3） 2.93g， 加 蒸 馏 水 至 1000mL， 置 2 8 保 存 备 用 。水 的 规 格 符 合 GB/T 6682
