1、ICS 65.020.30CCS B 41 DB42湖 北 省 地 方 标 准DB 42/T 1593 20204 型 禽 腺 病 毒 抗 体 ELISA检 测 规 程 Technical procedures of the ELISA assays for detection of type 4 avian adenovirus 2020 -07- 07发 布 2020- 11-07实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T 2020 I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 实 验 原
2、 理 .15 检 测 条 件 .16 检 测 方 法 .2 7 结 果 判 定 .38 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施 .3附 录 A（ 规 范 性 附 录 ） 试 剂 的 配 制 .4 DB42/T 2020 II 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 给 出 的 规则 起 草 。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 管 理 。本 文 件 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 ， 武 汉 科 前
3、 生 物 股 份 有 限 公 司 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 金 梅 林 、 张 雪 、 邹 忠 、 林 显 、 孙 小 美 、 董 晓 辉 、 徐 高 原 。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821， 邮 箱 ：； 华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话 ： 027-87282038， 邮 箱 ： 。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286905， 邮 箱 ： 。 DB42/T 2020 III
4、 引 言禽 腺 病 毒 属 于 禽 腺 病 毒 科 禽 腺 病 毒 属 ， 根 据 其 抗 原 性 的 不 同 可 分 为 3个 群 ， 根 据 血 清 中 和 反 应 I群 禽腺 病 毒 包 含 12个 血 清 型 ， 4型 禽 腺 病 毒 主 要 感 染 3周 龄 5周 龄 鸡 。 我 国 主 要 流 行 血 清 型 有 ： 2型 、 4型 、8a/b型 和 10型 。 近 期 在 豫 南 、 皖 北 、 苏 北 、 鲁 西 北 和 胶 东 地 区 流 行 的 禽 腺 病 毒 主 要 是 血 清 4型 和 8a/b型 ，造 成 鸡 群 的 死 亡 率 较 高 ， 发 病 急 ， 有 蔓 延
5、 的 趋 势 。 对 我 国 的 养 禽 业 造 成 了 巨 大 的 经 济 损 失 。 DB42/T 2020 1 4 型 禽 腺 病 毒 抗 体 ELISA 检 测 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 4型 禽 腺 病 毒 抗 体 ELISA检 测 的 术 语 和 定 义 、 实 验 原 理 、 检 测 条 件 、 检 测 方 法 、 结 果 判定 、 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施 。本 文 件 适 用 于 4型 禽 腺 病 毒 鸡 血 清 抗 体 的 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的
6、。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 GB/T 6682-2008 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 。3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义 。4 实 验 原 理本 文 件 采 用 酶 联 免 疫 吸 附 法 （ ELISA） ， 该 方 法 利 用 抗 原 抗 体 反 应 具 有 特 异 性 ， 将 特 异 性 的 4型 禽
7、腺病 毒 五 邻 体 蛋 白 （ penton） 吸 附 到 固 相 载 体 的 表 面 后 ， 待 测 物 中 若 含 有 相 应 的 4型 禽 腺 病 毒 抗 体 ， 则 可与 所 包 被 的 五 邻 体 蛋 白 （ penton） 相 结 合 ， 并 能 继 续 和 相 应 的 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鸡 IgG抗 体 结 合 形成 复 合 物 。 加 入 酶 反 应 的 底 物 后 ， 底 物 被 酶 催 化 成 为 有 色 产 物 ， 产 物 的 量 与 待 测 物 中 4型 禽 腺 病 毒 抗 体的 量 直 接 相 关 ， 故 可 根 据 呈 色 的 深 浅 进 行
8、 定 性 或 定 量 分 析 。 由 于 酶 的 催 化 效 率 很 高 ， 间 接 地 放 大 了 免 疫 反 应 的 结 果 ， 使 测 定 方 法 达 到 很 高 的 敏 感 度 。5 检 测 条 件5.1 试 剂 及 耗 材5.1.1 试 剂纯 化 的 4型 禽 腺 病 毒 五 邻 体 蛋 白 （ penton） 、 酶 标 记 物 （ 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鸡 IgG抗 体 ） 、 底 物液 显 色 液 、 终 止 液 、 阳 性 对 照 、 阴 性 对 照 、 样 品 稀 释 液 、 20倍 浓 缩 洗 涤 液 、 包 被 液 、 封 闭 液 。试 剂 配 方 及
9、 4型 禽 腺 病 毒 五 邻 体 蛋 白 、 阳 性 对 照 、 阴 性 对 照 的 制 备 见 附 录 A。5.1.2 耗 材酶 标 板 （ 96孔 ） 。 5.2 设 备 DB42/T 2020 2 酶 标 检 测 仪 （ 配 备 450nm滤 光 片 ） 、 单 道 移 液 器 （ 10L） 、 8道 移 液 器 （ 300L） 、 微 量 振 荡 器 、 恒温 箱 （ 37 ） 。6 检 测 方 法6.1 抗 原 包 被 板 的 制 备6.1.1 包 被将 纯 化 的 4型 禽 腺 病 毒 五 邻 体 蛋 白 （ penton） 用 包 被 液 稀 释 到 0.625ng/L， 加
10、入 酶 标 板 中 ， 每 孔 加100L， 2 8 包 被 12-15h。6.1.2 封 闭弃 去 包 被 液 ， 每 孔 加 入 封 闭 液 200L， 置 37 恒 温 箱 中 温 育 2h； 弃 去 孔 中 液 体 ， 再 置 37 恒 温 箱 中 干 燥 2h， 密 封 2 8 保 存 。6.2 洗 涤 液 的 配 制使 用 前 ， 将 20倍 浓 缩 洗 涤 液 恢 复 至 室 温 22 25 ， 并 摇 动 使 沉 淀 溶 解 ， 按 照 50mL 20倍 浓 缩 洗 涤液 加 入 950mL去 离 子 水 的 比 例 稀 释 ， 稀 释 好 的 洗 涤 液 在 2 8 保 存
11、， 有 效 期 为 7日 。6.3 待 检 血 清 的 稀 释将 5L血 清 加 入 到 95L样 品 稀 释 液 中 ， 微 量 振 荡 器 混 匀 ， 再 取 5L混 匀 后 的 血 清 加 入 到 120L样 品 稀释 液 中 ， 微 量 振 荡 器 混 匀 备 用 。6.4 检 测 步 骤6.4.1 待 检 样 品 温 育 从 冷 藏 环 境 中 取 出 包 被 板 ， 平 衡 至 室 温 22 25 后 打 开 使 用 。 先 用 洗 涤 液 洗 涤 抗 原 包 被 板 1次 ，弃 去 孔 中 洗 涤 液 ， 将 稀 释 好 的 待 检 血 清 、 阴 性 对 照 和 阳 性 对 照
12、 各 取 100L， 加 至 抗 原 包 被 板 中 ， 阴 、 阳性 对 照 各 设 2孔 ， 置 37 恒 温 箱 中 温 育 45min。阴 性 对 照 血 清 和 阳 性 对 照 血 清 无 需 稀 释 。6.4.2 洗 涤弃 去 孔 中 液 体 ， 每 孔 加 入 洗 涤 液 300L/孔 ， 重 复 洗 涤 4次 ， 最 后 一 次 拍 干 。6.4.3 酶 标 记 物 的 温 育将 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 的 鸡 IgG抗 体 用 封 闭 液 作 1:20000倍 稀 释 ， 每 孔 加 入 100L， 置 37 恒 温 箱 中温 育 45min。6.4.4 洗 涤
13、重 复 步 骤 5.4.2。6.4.5 底 物 显 色每 个 反 应 孔 加 入 底 物 显 色 液 100L， 置 22 28 下 避 光 显 色 15min。 DB42/T 2020 3 6.4.6 终 止每 孔 加 终 止 液 50L， 10min内 用 酶 标 仪 在 波 长 450nm处 测 定 各 孔 的 OD值 结 果 。7 结 果 判 定7.1 试 验 成 立 条 件两 个 阳 性 对 照 孔 的 OD 450nm值 均 1.0， 且 相 差 0.2； 阴 性 对 照 孔 OD450nm值 均 0.3时 试 验 成 立 。7.2 结 果 计 算Cut-off值 按 式 （ 1）
14、 确 定 ： NP NSCOoffCut ）值 （ （ 1）式 中 ：CO 阴 阳 性 判 定 临 界 值 ；S 样 品 测 定 孔 OD 450nm值 ；P 阳 性 对 照 孔 平 均 OD450nm值 ；N 阴 性 对 照 孔 平 均 OD450nm值 。7.3 结 果 判 定CO 0.15判 定 为 阳 性 ； CO 0.15判 定 为 阴 性 。8 废 弃 物 处 理 和 防 止 污 染 的 措 施实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 安 全 防 护 工 作 ， 废 弃 物 应 做 好 无 害 化 处 理 。 DB42/T 2020 4 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录
15、）试 剂 的 配 制A.1 包 被 液碳 酸 钠 （ Na 2CO3） 1.59g， 碳 酸 氢 钠 （ NaHCO3） 2.93g， 加 水 至 1000mL， 置 2 8 保 存 备 用 。 水 的规 格 符 合 GB/T 6682。A.2 洗 涤 液氯 化 钠 （ NaCl） 8g， 氯 化 钾 （ KCl） 0.2g， 十 二 水 磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO4 12H2O） 2.9g， 磷 酸 二 氢钾 （ KH2PO4） 0.2g， Tween-20 0.5mL， 加 水 至 1000mL， 置 2 -8 保 存 备 用 。 水 的 规 格 符 合 GB/T 6682。A.
16、3 底 物 液3,3,5,5-四 甲 基 联 苯 胺 （ TMB） 显 色 液 ， 置 2 8 保 存 备 用 。A.4 终 止 液 0.5mol/L 硫 酸 （ H2SO4） 。A.5 样 品 稀 释 液氯 化 钠 （ NaCl） 8g， 氯 化 钾 （ KCl） 0.2g， 十 二 水 磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO4 12H2O） 2.9g， 磷 酸 二 氢 钾（ KH2PO4） 0.2g， 加 至 1000mL， 置 2-8 保 存 备 用 。 水 的 规 格 符 合 GB/T 6682。A.6 封 闭 液牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 5g， 氯 化 钠 （ NaCl）
17、8g， 氯 化 钾 （ KCl） 0.2g， 十 二 水 磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO4 12H2O）2.9g， 磷 酸 二 氢 钾 （ KH2PO4） 0.2g， 硫 柳 汞 钠 0.2g， 加 水 至 1000mL， 置 2-8 保 存 备 用 。 水 的 规 格 符 合GB/T 6682。A.7 抗 原 制 备 （ 4型 禽 腺 病 毒 五 邻 体 蛋 白 制 备 ）将 I群 禽 腺 病 毒 4型 HB1502株 的 五 邻 体 蛋 白 （ penton） 基 因 克 隆 到 原 核 表 达 载 体 pET-32a上 。 将 构 建成 功 的 原 核 表 达 质 粒 pET-p
18、enton转 化 BL-21（ DE3） 感 受 态 中 。 挑 取 单 菌 落 进 行 诱 导 ， 用 SDS-PAGE和 westernblot进 行 鉴 定 。 将 成 功 表 达 五 邻 体 蛋 白 的 菌 种 接 种 于 含 25g/mL氨 苄 青 霉 素 的 LB培 养 基 中 ， 200r/min、37 摇 床 振 荡 培 养 8h 12h后 ， 置 2 8 保 存 过 夜 。 次 日 将 上 述 菌 液 按 1:100接 种 于 含 25g/mL氨 苄 青 霉素 的 LB培 养 基 中 ， 200r/min、 37 摇 床 振 荡 培 养 至 对 数 生 长 期 （ 菌 液 浓
19、 度 OD 600nm达 到 0.60） ， 用 终 浓 度0.1mmol/L的 IPTG 28 摇 床 诱 导 培 养 6h后 ， 取 出 菌 液 备 用 。 DB42/T 2020 5 将 诱 导 表 达 后 的 菌 液 12000r/min离 心 10min， 弃 上 清 ， 收 集 菌 体 。 收 集 的 菌 体 用 1/10培 养 基 体 积 的Binding buffer（ 50mmol/L Tris-Base， 0.01mmol/L咪 唑 ， pH7.9） 悬 浮 后 ， 用 压 力 破 碎 仪 充 分 破 碎 至半 透 明 。 破 碎 的 菌 液 经 12000r/min离 心
20、 20min， 收 集 上 清 并 过 滤 ， 置 2 8 备 用 。 采 用 组 氨 酸 层 析 柱 纯化 ， 纯 化 方 法 按 pET-32a表 达 载 体 纯 化 说 明 书 进 行 ， 具 体 方 法 如 下 ： 将 灌 制 好 的 预 装 柱 用 3倍 柱 体 积 的 20%无 水 乙 醇 清 洗 ， 再 用 Binding buffer平 衡 ， 待 监 测 仪 显 示 的 曲 线 平 衡 后 加 入 处 理 好 的 细 菌 上 清 液 ， 以 610倍 Washing buffer（ 50mmol/L Tris-Base， 0.01mmol/L咪 唑 ， pH7.9） 洗 去
21、未 结 合 的 杂 蛋 白 ， 用100%Elution buffer（ 50mmol/L Tris-Base， 0.01mmol/L咪 唑 ， pH7.9） 洗 脱 目 的 蛋 白 并 收 集 ， 最 后 用20%无 水 乙 醇 清 洗 预 装 柱 并 封 存 。 收 集 目 的 蛋 白 经 检 验 合 格 后 分 装 ， 置 -80 保 存 备 用 ， 作 为 4型 禽 腺 病毒 抗 体 ELISA检 测 规 程 的 包 被 抗 原 。A.8 阳 性 对 照 制 备实 验 室 分 离 纯 化 的 I群 禽 腺 病 毒 4型 HB1502株 ， 在 LMH细 胞 上 增 殖 ， 病 毒 滴
22、度 为 10 7.2TCID50/mL， 经 1甲 醛 灭 活 ， Marcol52佐 剂 乳 化 后 作 为 免 疫 原 免 疫 3-4周 龄 SPF鸡 。 颈 部 皮 下 免 疫 3次 ， 每 次 间 隔 14日 ， 第 1次 和 第 2次 免 疫 0.2mL/只 ， 第 3次 免 疫 0.5mL/只 ， 末 次 免 疫 后 14日 采 血 用 BioChek禽 腺 病 毒 1群 （ FADV-1）抗 体 检 测 试 剂 盒 检 测 抗 体 效 价 。待 检 血 清 ELISA效 价 达 到 1:640以 上 ， 采 取 颈 部 动 脉 采 血 方 式 ， 无 菌 采 集 血 液 ， 待
23、血 液 充 分 凝 固 后 ，4000r/min离 心 10min分 离 血 清 离 心 分 离 血 清 。 按 血 清 量 的 0.04 加 入 硫 柳 汞 ， 并 将 血 清 用 样 品 稀 释 液 进行 稀 释 ， 调 整 到 4型 禽 腺 病 毒 抗 体 ELISA检 测 方 法 检 测 OD 450nm值 在 1.6 2.0之 间 。 0.22m滤 器 过 滤 除 菌 分装 ， 1mL/管 ， 置 2 8 保 存 备 用 ， 作 为 4型 禽 腺 病 毒 抗 体 ELISA检 测 规 程 的 阳 性 对 照 。A.9 阴 性 对 照 制 备选 用 7-8周 龄 SPF鸡 （ 用 Bi
24、oChek禽 腺 病 毒 1群 （ FADV-1） 抗 体 检 测 试 剂 盒 和 聚 合 酶 链 式 扩 增 反 应 （ PCR）检 测 4型 禽 腺 病 毒 抗 体 与 抗 原 为 阴 性 ） ， 隔 离 观 察 7日 。采 取 颈 部 动 脉 采 血 方 式 ， 无 菌 采 集 血 液 ， 待 血 液 充 分 凝 固 后 ， 4000r/min离 心 10min分 离 血 清 离 心 分离 血 清 。 按 血 清 量 的 0.04 加 入 硫 柳 汞 ， 并 将 血 清 用 样 品 稀 释 液 进 行 1:500倍 稀 释 。 0.22m滤 器 过 滤 除菌 分 装 ， 1mL/管 ， 置 2 8 保 存 备 用 ， 4型 禽 腺 病 毒 抗 体 ELISA检 测 规 程 的 阴 性 对 照 。 _
