1、ICS 65.020.30CCS B 41 DB42湖 北 省 地 方 标 准DB 42/T 1594 2020猪 丹 毒 （ 红 斑 丹 毒 丝 菌 ） PCR鉴 别 诊 断 技 术规 程 Technical procedures of PCR differential diagnosis for detection of virulent andavirulent swine erysipelas (Erysipelothrixrhusiopathiae) 2020 -07- 07发 布 2020- 11-07实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T XXXXX2
2、020 I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 与 定 义 .14 检 测 原 理 .15 检 测 条 件 .16 检 测 方 法 .2 7 结 果 判 定 .28 注 意 事 项 .2附 录 A（ 规 范 性 附 录 ） 试 剂 的 配 制 .3 DB42/T XXXXX2020 II 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 给 出 的 规则 起 草 。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 文 件 由
3、湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口 管 理 。本 文 件 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 、 武 汉 科 前 生 物 股 份 有 限 公 司 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 金 梅 林 、 吴 超 、 朱 伟 峰 、 孙 小 美 、 范 俊 青 、 康 超 、 徐 高 原 。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821， 邮 箱 ：； 华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话 ： 027-87282038， 邮 箱 ： 。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请
4、 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286905， 邮 箱 ： 。 DB42/T XXXXX2020 III 引 言猪 丹 毒 是 一 种 重 要 的 人 畜 共 患 病 ， 由 红 斑 丹 毒 丝 菌 （ 俗 称 猪 丹 毒 杆 菌 ） 引 起 。 猪 丹 毒 可 导 致 生 猪 从业 人 员 中 的 特 定 人 群 感 染 和 死 亡 ， 严 重 危 害 人 类 健 康 ， 同 时 给 我 国 养 猪 业 造 成 巨 大 经 济 损 失 。 为 此 ， 制定 了 猪 丹 毒 （ 红 斑 丹 毒 丝 菌 ） PCR鉴 别 诊 断 技 术 规 程 标 准 ， 建
5、立 了 一 种 既 可 以 鉴 定 红 斑 丹 毒 丝 菌 临床 分 离 株 又 可 以 同 时 区 分 疫 苗 菌 株 和 野 生 型 菌 株 的 双 重 PCR方 法 ， 有 利 于 该 病 的 早 发 现 、 早 报 告 、 早 处置 ， 为 防 控 节 省 时 间 ， 为 猪 丹 毒 的 快 速 诊 断 、 猪 丹 毒 野 生 毒 株 与 疫 苗 弱 毒 株 的 鉴 别 诊 断 提 供 了 精 确 简 便的 分 子 生 物 学 方 法 ， 对 当 前 防 控 猪 丹 毒 具 有 重 大 意 义 。 DB42/T XXXXX2020 1 猪 丹 毒 （ 红 斑 丹 毒 丝 菌 ） PCR
6、 鉴 别 诊 断 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 猪 丹 毒 （ 红 斑 丹 毒 丝 菌 ） PCR鉴 别 诊 断 技 术 的 术 语 与 定 义 、 检 测 原 理 、 检 测 条 件 、 检测 方 法 、 结 果 判 定 等 。本 文 件 适 用 于 猪 丹 毒 （ 红 斑 丹 毒 丝 菌 ） 的 鉴 别 诊 断 。2 规 范 性 引 用 文 件本 文 件 没 有 规 范 性 引 用 文 件 。 3 术 语 与 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准3.1 双 重 PCR法 duplex PCR指 在 同 一 PCR反 应 体 系 里 加 入 两 对 引
7、物 ， 针 对 两 个 DNA模 板 或 者 同 一 个 DNA模 板 的 两 个 不 同 区 域 进 行扩 增 ， 最 多 可 同 时 扩 增 出 两 条 核 酸 片 段 的 PCR反 应 。4 检 测 原 理利 用 红 斑 丹 毒 丝 菌 弱 毒 疫 苗 株 G4T10和 GC42与 野 毒 株 关 于 DNA聚 合 酶 IV基 因 上 的 差 异 ， 设 计 猪 丹 毒 疫 苗 株 的 特 异 性 引 物 ， 结 合 猪 丹 毒 杆 菌 的 种 特 异 性 引 物 ， 建 立 起 一 种 快 速 检 测 猪 丹 毒 菌 株 并 同 时 区 分 猪 丹毒 弱 毒 疫 苗 株 和 野 毒 株
8、 的 双 重 PCR法 。5 检 测 条 件5.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 室 温 下 进 行 。5.2 仪 器 及 耗 材PCR仪 、 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 仪 、 组 织 研 磨 仪 、 凝 胶 成 像 系 统 、 电 磁 炉 、 微 量 移 液 器 （ 0.1L-2.5 L、0.5L -10L、 5L-50L、 10L -100L、 100L -1mL） 、 离 心 机 （ 12000rpm） 、 恒 温 箱 （ 37 ） 、 水浴 锅 （ 55-60 ） 、 电 子 天 平 （ 0.01g-300g） 离 心 管 （ 0.2mL、 1.5mL） 5.3 试 剂 DB42
9、/T XXXXX2020 2 DNA聚 合 酶 EasyTaq、 EasyTaq 10buffer、 dNTPs、 去 离 子 水 、 DNA Marker（ 包 含 500 bp， 1000 bp条 带 ） 、 阳 性 对 照 1、 阳 性 对 照 2、 阴 性 对 照 、 蛋 白 酶 K（ 100g/mL） 、 Gold View核 酸 染 料 、 溴 酚 蓝 上样 缓 冲 液 、 琼 脂 糖 凝 胶 （ 10g/L） 、 PBS缓 冲 液 、 TAE电 泳 缓 冲 液 、 引 物 。6 检 测 方 法6.1 样 品 准 备采 集 发 病 猪 的 心 、 肺 、 肾 、 肝 、 脾 、 脑
10、 及 关 节 样 品 组 织 ， 将 0.5g样 品 组 织 剪 碎 加 入 2mL PBS匀 浆 ，匀 浆 操 作 时 间 30秒 ， 共 3次 。 于 37 培 养 5h， 加 蛋 白 酶 K（ 100g/mL） 于 55-60 水 浴 1h。 取 1mL消 化 产物 于 离 心 管 中 ， 沸 水 中 加 热 5min并 快 速 置 于 冰 浴 中 5min， 12000rpm离 心 2min， 取 上 清 即 为 样 品 DNA。6.2 PCR扩 增 以 提 取 的 样 品 DNA为 模 板 进 行 PCR反 应 。PCR反 应 体 系 （ 25L） ： 引 物 vaccine-F 2
11、0mol/L 1L， 引 物 vaccine-R20mol/L 1L， ER1 20mol/L1L， ER2 20mol/L 1L， dNTPs 2L， EasyTaq 0.5L， EasyTaq 10buffer 2.5L， 去 离 子 水 15L，样 本 DNA 1L。PCR反 应 条 件 ： 1： 94 2min； 2： 94 30sec； 3： 55 30sec； 4： 72 1min； 5： 72 2min，其 中 2， 3， 4循 环 35次 。6.3 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳PCR反 应 扩 增 完 成 后 ， 向 产 物 中 加 入 0.1%的 溴 酚 蓝 上 样 缓 冲 液
12、 。 使 用 1倍 TAE电 泳 缓 冲 液 配 制 10g/L的 琼 脂 糖 凝 胶 ， 凝 胶 中 加 入 0.005%的 GoldView染 料 进 行 染 色 。 电 泳 完 成 后 于 凝 胶 成 像 系 统 下 观 察 。7 结 果 判 定 阳 性 对 照 1扩 增 出 453bp片 段 和 937bp片 段 ， 阳 性 对 照 2扩 增 出 937bp片 段 ， 阴 性 对 照 不 能 扩 增 出 任 何片 段 ， 判 定 为 检 测 结 果 成 立 ， 否 则 判 定 为 检 测 结 果 不 成 立 。在 试 验 结 果 成 立 的 前 提 下 ， 同 时 扩 增 出 453b
13、p和 937bp片 段 ， 判 定 为 猪 丹 毒 疫 苗 株 ； 仅 扩 增 出 937bp片 段 ， 判 定 为 猪 丹 毒 野 毒 株 。8 注 意 事 项采 样 及 检 测 过 程 中 应 注 意 个 人 防 护 ， 戴 口 罩 和 手 套 、 穿 工 作 服 ； 在 无 污 染 环 境 中 操 作 ， 及 时 清 理 物品 ， 用 75%酒 精 对 操 作 区 域 消 毒 处 理 ； 废 弃 物 经 高 压 灭 菌 后 按 有 关 规 定 处 理 。 DB42/T XXXXX2020 3 AA附 录 A（ 规 范 性 ）试 剂 的 配 制A.1 商 品 化 试 剂DNA聚 合 酶 E
14、asyTaq、 EasyTaq 10buffer、 dNTPs、 去 离 子 水 、 蛋 白 酶 K、 琼 脂 糖 、 溴 酚 蓝 上 样 缓 冲液 、 GoldView染 料 ， 均 为 商 品 化 试 剂 。A.2 阳 性 对 照 和 阴 性 对 照 阳 性 对 照 1： 红 斑 丹 毒 丝 菌 G4T10疫 苗 株 全 基 因 组 DNA阳 性 对 照 2： 红 斑 丹 毒 丝 菌 1a型 标 准 强 毒 C43-8株 全 基 因 组 DNA阴 性 对 照 ： 去 离 子 水 。A.3 PBS缓 冲 液氯 化 钠 （ NaCl） 8g， 氯 化 钾 （ KCl） 0.2g， 十 二 水
15、磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO4 12H2O） 2.9g， 磷 酸 二 氢钾 （ KH 2PO4） 0.2g， 加 水 至 1000mL， 置 2-8 保 存 备 用 。A.4 TAE电 泳 缓 冲 液50倍 TAE缓 冲 液 制 备 ： 称 取 Tris 盐 242g， Na2 EDTA.2H2O 37.2g溶 于 约 600mL的 去 离 子 水 ， 充 分 搅 拌溶 解 ； 加 入 57.1mL的 醋 酸 ， 充 分 搅 拌 ； 加 去 离 子 水 将 溶 液 定 容 至 1L后 ， 室 温 保 存 。A.5 琼 脂 糖 凝 胶 （ 10g/L）称 取 1g琼 脂 糖 ， 加 入 1倍 的 TAE电 泳 缓 冲 液 100mL， 微 波 炉 中 加 热 至 琼 脂 糖 完 成 溶 解 。A.6 引 物 序 列 vaccine-F： 5AGTGATGAAACTGATTCGTGCTC 3，vaccine-R： 5GCCTAAATTAAACCACTTGCACACA 3，ER1： 5CGA TTATATTCTTAGCACGCAACG 3，ER2： 5TGCTTGTGTTGTGATT TCTTGACG 3。_
