1、ICS 11.220CCS B 41 DB42湖 北 省 地 方 标 准DB 42/T 1586 2020牛 沙 门 氏 菌 病 诊 断 技 术 规 程 Diagnostic technical guideline for bovine salmonellosis 2020 -07- 07发 布 2020- 11-07实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T XXXX2020 I 目 次前 言 .II1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .15 临 床 初 步 诊 断 .16 实 验 室 诊 断 .26.1 检
2、 验 程 序 .2 6.2 主 要 仪 器 与 耗 材 .26.3 培 养 基 和 试 剂 .26.4 操 作 步 骤 .37 诊 断 检 验 流 程 .58 结 果 判 定 .58.1 结 果 记 录 与 判 定 .58.2 诊 断 报 告 .5附 录 A （ 规 范 性 ） 试 剂 配 制 （ 分 析 纯 ） . 6附 录 B （ 资 料 性 ） 牛 沙 门 氏 菌 诊 断 结 果 记 录 表 .7附 录 C （ 资 料 性 ） 牛 沙 门 氏 菌 病 诊 断 检 验 流 程 图 .8 DB42/T XXXX2020 II 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化
3、工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 的 附 录 A为 规 范 性 附 录 ， 附 录 B和 附 录 C为 资 料 性 附 录 。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口 。本 文 件 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 、 湖 北 劲 牛 牧 业 有 限 公 司 、 松 滋 市 春 珍 肉 牛 养 殖 场 、 随 州 市 弘 大 畜牧 有 限 责 任 公 司 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 郭 爱 珍 、 王 杰 、 陈 颖 钰 、
4、王 宇 、 王 琛 、 胡 长 敏 、 栗 绍 文 、 陈 焕 春 、 彭 清 洁 、 曹永 强 、 周 春 、 曾 稳 兵 。 本 标 准 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821， 邮 箱 ：； 华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话 ： 027-87282038， 邮 箱 ： 。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286861， 邮 箱 ：。 DB42/T XXXX2020 1 牛 沙 门 氏 菌 病 诊 断 技
5、术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 牛 沙 门 氏 菌 病 的 临 床 初 步 诊 断 、 实 验 室 诊 断 、 诊 断 检 验 流 程 及 结 果 判 断 的 技 术 要 求 。本 文 件 适 用 于 湖 北 省 范 围 内 牛 沙 门 氏 菌 病 的 诊 断 、 检 疫 与 监 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文
6、件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB/T 4789.4 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 沙 门 氏 菌 检 验GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义 。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。bp： 碱 基 对 （ base pair） BPW： 缓 冲 蛋 白 胨 水 （ buffered peptone water）BS： 亚 硫 酸 铋 （ bismuth sulfite）D
7、NA： 脱 氧 核 糖 核 酸 （ deoxyribonucleic acid）EDTA： 乙 二 胺 四 乙 酸 （ ethylene diamine tetraacetic acid）EP： 微 型 离 心 管 （ eppendorf tube）PCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 （ polymerase chain reaction）stn： 沙 门 氏 菌 肠 毒 素 基 因 （ salmonella enterotoxin gene）TAE： 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 、 乙 酸 和 乙 二 胺 四 乙 酸 缓 冲 液 （ tris base,acetic acid and
8、ethylenediamine tetraacetic acid buffer）TTB： 四 硫 磺 酸 钠 煌 绿 增 菌 液 （ tetrathionate broth） 5 临 床 初 步 诊 断对 犊 牛 进 行 临 床 观 察 ， 体 温 升 高 至 40 41 ， 精 神 沉 郁 ， 呼 吸 加 快 ， 食 欲 降 低 或 废 绝 ， 出 现 明显 腹 泻 症 状 ， 排 出 黄 色 或 灰 黄 色 难 闻 稀 粪 ， 或 排 泄 物 含 黏 膜 碎 片 和 黏 液 或 血 丝 ， 或 呈 血 汤 样 者 ， 初 步 判 DB42/T XXXX2020 2 定 为 犊 牛 沙 门
9、氏 菌 病 。 填 写 附 录 B， 将 “ 临 床 初 步 诊 断 ” 栏 记 录 为 “ +” 并 进 行 下 一 步 操 作 。 否 则 判 定 为无 沙 门 氏 菌 病 。6 实 验 室 诊 断6.1 检 验 程 序包 括 病 料 预 增 菌 、 PCR初 筛 、 可 疑 菌 落 生 化 鉴 定 和 PCR验 证 、 血 清 型 鉴 定 等 步 骤 。6.2 主 要 仪 器 与 耗 材6.2.1 仪 器仪 器 主 要 包 括 ： a) 涡 旋 仪 ；b） 恒 温 培 养 箱 ： 36 1 ， 42 1 ；c） 水 浴 锅 ；d） 离 心 机 ；e） PCR仪 ；f） 核 酸 电 泳 仪
10、 ；g） 紫 外 灯 ；h） 高 压 消 毒 锅 ；i） 超 净 工 作 台 或 生 物 安 全 柜 。6.2.2 耗 材 耗 材 主 要 包 括 ：a） EP管 和 离 心 管 ： 容 量 1.5 mL、 10 mL、 15 mL；b） 培 养 皿 ： 直 径 90 mm；c） PCR反 应 管 ；d） 无 菌 棉 签 ；e） 接 种 环 。6.3 培 养 基 和 试 剂6.3.1 BPW培 养 基相 关 试 剂 配 制 应 符 合 附 录 A.1的 规 定 。6.3.2 TTB增 菌 液 相 关 试 剂 应 符 合 附 录 A.2的 规 定 。6.3.3 BS琼 脂 培 养 基相 关 试
11、剂 应 符 合 附 录 A.3的 规 定 。6.3.4 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 、 乙 酸 和 TAE缓 冲 液 DB42/T XXXX2020 3 相 关 试 剂 应 符 合 附 录 A.4的 规 定 。6.3.5 琼 脂 糖相 关 试 剂 应 符 合 附 录 A.5的 规 定 。6.3.6 生 化 鉴 定 试 剂商 业 化 生 化 管 或 生 化 鉴 定 试 剂 盒 或 全 自 动 微 生 物 生 化 鉴 定 系 统 。6.3.7 沙 门 氏 菌 鼠 伤 寒 标 准 株商 业 化 鼠 伤 寒 沙 门 菌 标 准 菌 株 。6.4 操 作 步 骤6.4.1 病 料 的 采 集 将 用
12、 BPW增 菌 液 充 分 润 湿 的 无 菌 棉 签 插 入 肛 门 搅 动 3 5 圈 后 置 于 装 有 5 mLBPW增 菌 液 的 10 mL规 格 离心 管 中 ， 冷 藏 条 件 下 在 24 h之 内 送 检 。所 有 样 本 均 须 妥 善 包 装 ， 防 渗 漏 ， 防 破 碎 。 标 记 信 息 完 整 、 清 晰 ， 并 附 采 样 单 。6.4.2 预 增 菌6.4.2.1 将 5.4.1 中 装 有 样 品 的 离 心 管 用 涡 旋 仪 振 荡 1 min， 置 于 36 1 培 养 箱 中 培 养 8 h 18h。6.4.2.2 吸 取 5 L 沙 门 氏 菌
13、参 考 菌 株 纯 培 养 物 于 装 有 5mLBPW 增 菌 液 的 EP 管 中 ， 充 分 混 合 后 ， 置 于36 1 培 养 箱 中 培 养 8 h 18 h， 作 为 阳 性 对 照 。6.4.2.3 吸 取 5 L 灭 菌 生 理 盐 水 于 装 有 5 mL BPW增 菌 液 的 EP管 中 ， 充 分 混 合 后 ， 置 于 36 1 培 养 箱 中 培 养 8 h 18 h， 作 为 空 白 对 照 。6.4.3 选 择 性 增 菌 将 5.4.2中 培 养 好 的 混 合 物 轻 轻 摇 动 混 匀 ， 在 无 菌 条 件 下 吸 取 1 mL转 接 于 装 有 10
14、 mL TTB的 15 mL离心 管 中 ， 置 于 42 1 培 养 基 中 培 养 18 h 24 h。可 选 择 继 续 5.4.4操 作 步 骤 或 直 接 进 入 5.4.5操 作 步 骤 。6.4.4 PCR初 筛 检 测6.4.4.1 引 物针 对 沙 门 氏 菌 stn 基 因 设 计 特 异 性 引 物 后 并 合 成 。 序 列 如 下 ：a) 上 游 引 物 ： 5CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG 3；b) 下 游 引 物 ： 5TGCCCAAAGCAGAGAGATTC 3。6.4.4.2 模 板 提 取 将 5.4.3中 的 3种 培 养 物 轻 轻 混 匀
15、。 各 吸 取 1mL培 养 物 于 1.5mL无 菌 EP管 中 ， 10000 r/min 离 心 5 min，弃 上 清 ， 加 入 0.2 mL无 菌 去 离 子 水 充 分 混 合 分 散 ， 于 8000 r/min离 心 2 min， 弃 上 清 ， 再 加 入 0.2 mL无菌 去 离 子 水 充 分 混 合 分 散 ， 再 于 8000 r/min离 心 2 min， 弃 上 清 后 用 0.1 mL无 菌 去 离 子 水 充 分 混 合 分 散 ， DB42/T XXXX2020 4 用 水 浴 锅 煮 沸 10 min后 迅 速 移 至 碎 冰 块 上 ， 使 其 迅 速
16、 冷 却 10 min。 最 后 用 8000 r/min离 心 2 min， 吸 取上 清 ， 做 为 模 板 备 用 。6.4.4.3 PCR反 应 体 系总 体 积 25 L： 将 2 Taq Mixture 12.5 L， 模 板 2 L， 上 下 游 引 物 （ 浓 度 为 10 / L） 各0.5 L， 去 离 子 水 9.5 L， 加 入 PCR反 应 管 中 ， 充 分 混 合 。6.4.4.4 PCR反 应 程 序将 5.4.4.3中 PCR反 应 管 放 置 于 PCR仪 中 ， 设 定 反 应 程 序 进 行 扩 增 ： 94 4 min， 进 入 循 环 扩 增 阶 段
17、 ：94 1 min， 56 0.5min， 72 0.5 min， 循 环 35次 ， 72 10 min。6.4.4.5 PCR 反 应 产 物 检 测 将 PCR产 物 进 行 1.5%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ， 100 V， 100 mA条 件 下 电 泳 40 min。 紫 外 灯 下 观 察 扩 增 产 物 ，阳 性 对 照 PCR产 物 大 小 为 260 bp， 空 白 对 照 PCR产 物 无 条 带 时 ， 反 应 成 立 。当 样 本 PCR产 物 与 阳 性 对 照 产 物 大 小 一 致 时 （ 260 bp） ， 继 续 下 一 步 操 作 。当 样 本 PCR
18、产 物 与 阳 性 对 照 产 物 大 小 不 一 致 时 ， 表 明 样 本 无 沙 门 氏 菌 。6.4.5 细 菌 分 离 培 养用 直 径 为 3 mm的 接 种 环 接 取 5.4.3中 培 养 液 1环 ， 划 线 接 种 于 BS琼 脂 培 养 基 ， 于 36 1 培 养 箱中 培 养 40 h 48 h， 观 察 菌 落 形 态 。当 呈 现 下 列 形 态 时 ， 填 写 附 录 B中 表 B.1， 将 “ 细 菌 分 离 培 养 ” 栏 记 录 为 “ +” 并 继 续 5.4.6操 作 步 骤或 5.4.7操 作 步 骤 （ 二 者 选 其 一 操 作 即 可 ） ：
19、菌 落 为 黑 色 有 金 属 光 泽 、 棕 褐 色 或 者 灰 色 ， 菌 落 周 围 培 养基 可 呈 黑 色 或 棕 色 ， 或 菌 株 形 成 灰 绿 色 的 菌 落 ， 但 周 围 培 养 基 颜 色 不 变 。 否 则 表 明 样 本 无 沙 门 氏 菌 。6.4.6 PCR鉴 定 可 疑 菌 落用 接 种 环 蘸 取 5.4.5 培 养 物 中 典 型 菌 落 大 小 的 一 半 置 于 装 有 50 L无 菌 去 离 子 水 的 无 菌 PCR反 应 管中 ， 在 涡 旋 仪 上 涡 旋 10 s后 煮 沸 10 min， 迅 速 移 至 碎 冰 中 冷 却 10 min后
20、8000 r/min离 心 2 min， 吸 取 上清 做 为 PCR模 板 。 依 照 5.4.4.3和 5.4.4.4所 示 方 法 进 行 PCR扩 增 ， 依 照 5.4.4.5所 示 方 法 进 行 PCR反 应 产 物的 检 测 ， 并 将 PCR产 物 送 商 业 公 司 测 序 ， 与 stn基 因 进 行 同 源 性 比 较 ， 同 源 性 在 99%以 上 时 填 写 附 录 B， 将“ PCR鉴 定 可 疑 菌 落 栏 ” 记 录 为 “ +” 并 继 续 5.4.8操 作 。 否 则 表 明 该 样 本 无 沙 门 氏 菌 。6.4.7 生 化 鉴 定挑 取 5.4.5
21、中 2 个 以 上 典 型 菌 落 ， 使 用 商 业 化 的 生 化 管 或 者 生 化 鉴 定 试 剂 盒 或 全 自 动 微 生 物 生 化 鉴定 系 统 ， 按 照 GB 4789.4中 5.4 中 的 步 骤 进 行 生 化 试 验 和 判 定 。 符 合 沙 门 氏 菌 生 化 特 征 则 填 写 附 录 B表 B.1， 将 “ 生 化 鉴 定 ” 栏 记 录 为 “ +” 并 进 行 下 一 步 操 作 。 否则 样 本 判 定 为 无 沙 门 氏 菌 。可 选 择 5.4.8进 行 血 清 学 鉴 定 ， 或 直 接 进 行 结 果 判 定 。6.4.8 血 清 学 鉴 定 D
22、B42/T XXXX2020 5 挑 取 5.4.5菌 落 后 按 照 GB 4789.4 中 5.5规 定 执 行 。符 合 沙 门 氏 菌 血 清 学 特 征 则 应 按 照 附 录 B 中 表 B.1填 写 ， 将 “ 血 清 学 鉴 定 ” 栏 记 录 为 相 应 血 清 学 鉴定 结 果 。7 诊 断 检 验 流 程牛 沙 门 氏 菌 病 诊 断 检 验 流 程 见 附 录 C。所 有 污 染 材 料 、 多 余 样 本 和 细 菌 培 养 物 等 废 弃 物 应 依 照 GB 19489要 求 进 行 。 消 毒 灭 菌 后 按 照 国 务 院令 第 424号 要 求 作 为 医
23、疗 废 物 处 理 。8 结 果 判 定 8.1 结 果 记 录 与 判 定完 成 牛 沙 门 氏 菌 诊 断 结 果 记 录 ， 并 与 表 1进 行 比 对 ， 符 合 1、 2中 任 意 一 条 则 可 确 诊 牛 病 为 牛 沙 门 氏菌 病 。 表 1 牛 沙 门 氏 菌 病 诊 断 结 果 记 录 表临 床 症 状 细 菌 分 离 培 养 PCR鉴 定 可 疑 菌 落 生 化 鉴 定1 + + +2 + + +8.2 诊 断 报 告依 据 诊 断 结 果 出 具 诊 断 报 告 。 A DB42/T XXXX2020 6 AB附 录 A（ 规 范 性 ）试 剂 配 制 （ 分 析
24、纯 ）本 附 录 规 定 了 实 验 室 诊 断 中 所 需 试 剂 的 配 方 和 配 制 方 法 。A.1 BPW培 养 基2%缓 冲 蛋 白 胨 水 ： 将 2.0g缓 冲 蛋 白 胨 水 加 入 蒸 馏 水 定 容 至 100mL， 搅 拌 加 热 煮 沸 至 完 全 溶 解 ， 121 高 压 灭 菌 15 min。 冷 却 至 室 温 ， 备 用 。 A.2 TTB增 菌 液A.2.1 碘 溶 液将 25.0 g碘 化 钾 充 分 溶 解 于 少 量 的 蒸 馏 水 中 ， 再 投 入 20.0 g碘 片 ， 搅 拌 充 分 溶 解 后 加 蒸 馏 水 定 容 至100 mL， 贮
25、 存 于 棕 色 瓶 内 ， 塞 紧 瓶 盖 备 用 。A.2.2 煌 绿 水 溶 液0.5%煌 绿 水 溶 液 ： 将 0.5 g煌 绿 加 入 蒸 馏 水 定 容 至 100 mL， 充 分 溶 解 后 存 放 于 暗 处 ， 不 少 于 1 d。A.2.3 四 硫 磺 酸 钠 煌 绿 增 菌 液将 4.6 g四 硫 磺 酸 钠 煌 绿 基 础 培 养 基 加 热 溶 解 于 适 量 蒸 馏 水 中 ， 定 容 至 100 mL， 121 高 压 灭 菌 15min， 冷 却 至 室 温 。 临 用 前 ， 每 100mL培 养 基 加 入 碘 溶 液 2.0mL和 煌 绿 水 溶 液 1
26、.0mL， 混 匀 均 匀 ， 备 用 。 A.3 BS琼 脂 培 养 基5%亚 硫 酸 铋 琼 脂 ： 将 5.0 g亚 硫 酸 铋 琼 脂 加 入 蒸 馏 水 定 容 至 100 mL， 搅 拌 加 热 煮 沸 至 完 全 溶 解 ， 冷却 至 45 50 时 ， 轻 轻 摇 匀 后 倒 入 无 菌 平 皿 中 备 用 。 暗 处 保 存 ， 48 h内 使 用 。A.4 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 、 乙 酸 和 TAE缓 冲 液将 24.2 g三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 和 3.7 g二 水 合 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 加 入 适 量 去 离 子 水 中 ， 充 分 搅
27、 拌 溶 解后 ， 加 入 5.7 mL乙 酸 ， 充 分 搅 拌 混 合 后 加 去 离 子 水 定 容 至 100 mL。A.5 琼 脂 糖1.5%琼 脂 糖 凝 胶 ： 将 1.5 g琼 脂 糖 粉 加 入 100 mLTAE缓 冲 液 中 ， 加 热 充 分 溶 解 ， 冷 却 至 50 左 右 时 ， 加 入 10 L的 显 色 剂 （ Gel Red） ， 充 分 混 匀 ， 倒 入 核 酸 电 泳 槽 胶 槽 中 。 DB42/T XXXX2020 7 BC附 录 B（ 资 料 性 ）牛 沙 门 氏 菌 诊 断 结 果 记 录 表表 B.1 牛 沙 门 氏 菌 病 诊 断 结 果 记 录 表表 B.1给 出 了 牛 沙 门 氏 菌 诊 断 过 程 中 应 记 录 的 内 容 。样 品 编 号 临 床 症 状 细 菌 分 离 培 养 PCR鉴 定 生 化 鉴 定 DB42/T XXXX2020 8 CD附 录 C（ 资 料 性 ）牛 沙 门 氏 菌 病 诊 断 检 验 流 程 图图 C.1给 出 了 牛 沙 门 菌 病 的 诊 断 检 验 流 程 。 图 C.1 牛 沙 门 氏 菌 病 诊 断 检 验 流 程 图_
