1、ICS 65.020.30CCS B 41湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 1590 202042H7亚 型 禽 流 感 病 毒 胶 体 金 试 纸 条 抗 原 检 测方 法 Colloidal gold strips test for detecting of H7 subtype avian influenza virus 2020 -07- 07发 布 2020- 11-07实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12 规 范
2、性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 检 测 原 理 .15 检 测 条 件 .2 6 检 测 方 法 .27 结 果 判 定 .2附 录 A（ 规 范 性 ） 试 剂 配 制 .4附 录 B（ 资 料 性 ） H7 亚 型 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备 .5附 录 C（ 资 料 性 ） 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 .8附 录 D（ 资 料 性 ） 样 品 处 理 注 意 事 项 .9 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 II 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1 2020 标 准 化 工
3、 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草 。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口 。本 文 件 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 、 武 汉 科 前 生 物 股 份 有 限 公 司 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 金 梅 林 、 范 俊 青 、 李 冉 、 董 俊 、 王 园 园 、 但 汉 并 、 邹 忠 、 董 晓 辉 、 徐 高 原 。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话
4、： 027-87665821， 邮 箱 ：； 华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话 ： 027-87282038， 邮 箱 ： 。 对 本 文 件的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286905， 邮 箱 ： 。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 III 引 言禽 流 感 （ avian influenza, AI） 是 由 甲 型 流 感 病 毒 感 染 引 起 的 禽 类 急 性 传 染 病 。 按 照 致 病 力 的 强弱 可 分 为 无 致 病 性 禽 流 感
5、 、 低 致 病 性 禽 流 感 、 中 致 病 性 禽 流 感 和 高 致 病 性 禽 流 感 。 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 属于 高 致 病 性 禽 流 感 ， OIE将 高 致 病 性 禽 流 感 列 为 必 须 上 报 的 传 染 病 ， 我 国 将 其 列 为 是 优 先 防 治 和 重 点 防范 的 人 兽 共 患 病 。目 前 ， 检 测 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 的 方 法 主 要 是 荧 光 定 量 PCR方 法 ， 该 方 法 的 优 点 是 敏 感 性 高 ， 缺 点 是对 操 作 人 员 的 专 业 素 养 要 求 高 ， 试 验 条 件 苛 刻 ， 仪 器
6、 使 用 昂 贵 。 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 的 胶 体 金 检 测 方 法 ，是 一 种 现 场 快 速 检 测 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 的 方 法 ， 该 方 法 有 利 于 该 病 的 早 发 现 、 早 报 告 、 早 处 置 ， 为 防 控节 省 时 间 ； 同 时 给 临 床 检 测 提 供 一 种 简 单 ， 便 捷 的 检 测 工 具 ， 使 高 通 量 检 测 成 为 可 能 ， 从 而 切 实 为 实 际生 产 提 供 便 利 。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 1 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 胶
7、体 金 试 纸 条 抗 原 检 测 方 法1 范 围本 文 件 规 定 了 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 胶 体 金 试 纸 条 抗 原 检 测 的 术 语 和 定 义 、 检 测 原 理 、 检 测 条 件 、 检 测方 法 、 结 果 判 定 。本 文 件 适 用 于 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 的 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件本 文 件 没 有 规 范 性 引 用 文 件 。 3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义 。4 检 测 原 理本 文 件 采 用 双 抗 夹 心 检 测 抗 原 的 方 法 制 备 胶 体 金 试 纸 条
8、 ， 属 于 一 步 式 固 相 膜 反 应 。 首 先 制 备 两 株 具有 夹 心 效 果 的 H7亚 型 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 ， 一 株 单 抗 包 被 在 硝 酸 纤 维 素 膜 上 ， 另 一 株 单 抗 进 行 胶 体 金标 记 ， 固 定 在 金 垫 上 。 在 加 样 孔 处 （ A） 加 入 待 检 样 品 时 ， 待 检 样品 中 的 抗 原 先 与 胶 体 金 标 记 的 单 抗 进 行 反 应 ， 形 成 肉 眼 可 见 的 红 色 金 标 抗 体 -抗 原 结 合 物 。 然 后 ，经 毛 细 管 作 用 ， 该 红 色 结 合 物 继 续 层 析
9、 向 前 移 动 ， 与 硝 酸 纤 维 素 膜 上 的 单 抗 结 合 ， 在 观 察 窗 口 的 检 测 线（ T） 处 ， 红 色 结 合 物 中 的 抗 原 被 此 处 预 先 包 被 在 纤 维 素 膜 上 的 抗 体 捕 获 并 截 留 下 来 ， 随 着 红 色 结 合 物截 留 量 增 多 ， 逐 渐 形 成 一 条 红 线 ， 因 此 根 据 红 色 T线 的 出 现 即 可 判 定 样 品 为 阳 性 。 如 果 样 品 中 没 有 抗 原 ， 则 不 形 成 红 色 金 标 抗 体 -抗 原 结 合 物 ， 流 过 T线 时 ， 不 发 生 捕 获 截 留 ， T线 保
10、持 白 色 ， 判 定 样 品 为 阴 性 。（ 检 测 时 质 控 线 （ C） 处 出 现 红 线 检 测 结 果 有 效 ）胶 体 金 试 纸 条 结 构 如 图 1所 示 ： 注 ： A： 加 样 孔 ； S： 检 测 区 ； T： 检 测 线 ； C： 质 控 线图 1 胶 体 金 试 纸 条 结 构 示 意 图TA S C FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 2 5 检 测 条 件5.1 仪 器 与 耗 材 级 生 物 安 全 柜 或 者 超 净 工 作 台 、 冷 冻 离 心 机 （ 转 速 12,000r/min） 、 电 子
11、 天 平 （ 0.01g-300g） 、玻 璃 匀 浆 器 （ 5mL） 、 微 量 可 调 移 液 器 （ 200L、 1 mL） 、 枪 头 （ 200L、 1mL） 、 离 心 管 （ 1.5mL、 2mL、5mL） 。5.2 试 剂H7亚 型 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 、 样 本 处 理 液 、 生 理 盐 水试 剂 配 制 方 法 见 附 录 A。H7亚 型 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备 、 纯 化 及 鉴 定 见 附 录 B。 6 检 测 方 法6.1 样 品 处 理6.1.1 泄 殖 腔 拭 子 检 测 样 本 的 处 理 将 采 集 的 泄
12、殖 腔 棉 拭 子 插 入 到 含 有 处 理 液 的 离 心 管 中 ， 充 分 混 合 ，置 低 温 冷 冻 离 心 机 4 、 12,000r/min离 心 10min， 取 上 清 待 检 。6.1.2 内 脏 组 织 检 测 样 本 的 处 理 称 取 内 脏 组 织 块 0.5g， 置 于 匀 浆 器 中 ， 加 生 理 盐 水 1mL， 研 磨 完 全后 取 出 组 织 浸 出 液 至 离 心 管 中 ， 然 后 置 低 温 冷 冻 离 心 机 4 、 12,000r/min离 心 10min， 取 上 清 待 检 。6.1.3 鸡 胚 分 离 病 毒 尿 囊 液 样 本 的 处
13、 理 收 集 尿 囊 液 至 离 心 管 中 ， 置 低 温 冷 冻 离 心 机 4 、 12,000 r/min离 心 2min， 取 上 清 待 检 。6.1.4 细 胞 培 养 病 毒 样 本 的 处 理 细 胞 培 养 液 可 直 接 用 于 检 测 或 者 冻 融 一 次 后 检 测 。6.1.5 样 品 处 理 过 程 中 应 防 止 样 品 的 污 染 ， 注 意 个 人 安 全 防 护 ， 具 体 注 意 事 项 见 附 录 D。6.2 加 样 取 出 2 8 保 存 的 胶 体 金 试 纸 条 ， 并 恢 复 至 15 25 。 取 100L经 样 品 稀 释 液 处 理 好
14、 的 上 清 加入 加 样 孔 A中 ， 水 平 放 置 15min， 观 察 结 果 。胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 过 程 见 附 录 C。7 结 果 判 定7.1 阳 性 结 果 在 试 纸 条 上 出 现 两 条 红 色 条 带 （ T检 测 线 和 C 质 控 线 ） （ 见 图 2） 。7.2 阴 性 结 果 在 试 纸 条 上 仅 出 现 一 条 红 色 条 带 （ C 质 控 线 ） （ 见 图 3） 。7.3 无 效 结 果 无 红 色 条 带 出 现 （ 见 图 4） 。 注 ： A： 加 样 孔 ； S： 检 测 区 ； T： 检 测 线 ； C： 质 控 线 FO
15、RMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 3 图 2 阳 性 结 果注 ： A： 加 样 孔 ； S： 检 测 区 ； T： 检 测 线 ； C： 质 控 线图 3 阴 性 结 果 注 ： A： 加 样 孔 ； S： 检 测 区 ； T： 检 测 线 ； C： 质 控 线图 4 无 效 结 果 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 4 A附 录 A（ 规 范 性 ）试 剂 配 制A.1 样 本 处 理 液Tris base 24.2g， Triton-x 100 0.1mL， 加 蒸 馏 水 至 100
16、0mL， 调 pH值 为 9.0。A.2 生 理 盐 水氯 化 钠 （ NaCl） 8.5g， 加 蒸 馏 水 至 1000mL。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 5 附 录 B（ 资 料 性 ）H7亚 型 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 的 制 备B.1 单 克 隆 抗 体 的 制 备B.1.1 免 疫 原禽 流 感 病 毒 H7亚 型 血 凝 抑 制 试 验 抗 原 ， 加 入 pH值 7.4的 PBS2mL溶 解 ， 重 悬 后 的 溶 液 加 入 等 体 积 饱 和硫 酸 铵 搅 匀 ， 置 2 8 作 用 15h后 ，
17、2 8 8000r/min离 心 40min， 收 集 沉 淀 物 加 入 原 病 毒 液 1/20体 积 的 生 理 盐 水 溶 解 ， 装 透 析 袋 内 ， 用 PBS透 析 15h除 盐 。 最 后 ， 利 用 超 微 量 核 酸 蛋 白 测 定 仪 测 定 浓 缩 抗原 液 的 蛋 白 含 量 ， 加 入 终 浓 度 为 0.04 硫 柳 汞 钠 ， 并 调 整 病 毒 液 的 蛋 白 浓 度 至 20.05 mg/mL， 同 时 用HA试 验 检 测 该 病 毒 液 的 效 价 ， 当 其 HA效 价 28即 可 作 为 免 疫 原 。B.1.2 小 鼠 免 疫 首 次 免 疫 取
18、 免 疫 原 与 弗 氏 完 全 佐 剂 按 照 体 积 1:1进 行 乳 化 ， 6周 龄 8周 龄 雌 性 BALB/c小 鼠 3只 ， 皮 下分 点 注 射 200g/只 ， 每 个 点 约 注 射 20g。 以 后 每 间 隔 2周 免 疫 一 次 ， 第 二 、 三 次 免 疫 将 免 疫 原 与 弗 氏 不完 全 佐 剂 乳 化 ， 皮 下 分 点 注 射 100g/只 。 第 三 次 免 疫 后 一 周 后 ， 自 小 鼠 尾 静 脉 采 血 用 ELISA法 检 测 血 清抗 体 效 价 ， 选 择 效 价 高 的 小 鼠 在 融 合 前 3天 腹 腔 注 射 抗 原 （ 不
19、含 佐 剂 ） 约 200g进 行 加 强 免 疫 。B.1.3 骨 髓 瘤 细 胞 的 培 养融 合 前 一 周 复 苏 SP2/0骨 髓 瘤 细 胞 ， 培 养 在 含 20%胎 牛 血 清 的 RPMI1640培 养 基 中 。 选 择 处 于 对 数 生 长期 的 SP2/0， 以 RPMI1640培 养 基 洗 涤 两 次 后 ， 用 约 10mL RPMI1640培 养 基 将 其 吹 下 。 收 集 于 50mL离 心 管 ，1000r/min离 心 5min， 弃 上 清 液 ， 轻 轻 敲 打 管 底 使 细 胞 松 散 ， 加 入 10mLRPMI1640培 养 基 重 悬
20、 细 胞 。 将 细胞 悬 液 10倍 稀 释 后 计 数 ， 准 备 融 合 。B.1.4 免 疫 脾 细 胞 的 制 备取 加 强 免 疫 4天 后 的 小 鼠 ， 摘 取 眼 球 眼 眶 放 血 ， 获 得 阳 性 血 清 ， 脱 颈 处 死 ， 置 于 75%的 酒 精 中 浸 泡 10min， 无 菌 取 出 脾 脏 ， 先 用 RPMI1640培 养 基 洗 涤 数 次 ， 去 除 附 着 的 结 缔 组 织 ； 再 将 脾 脏 移 入 另 一 置 有 300目 微孔 滤 网 的 新 鲜 RPMI1640培 养 基 中 ， 眼 科 剪 刀 剪 开 一 个 小 口 ， 用 研 磨 棒
21、 轻 轻 挤 压 ， 释 放 脾 细 胞 ， 制 成 脾 细胞 悬 液 ， 移 至 10mL离 心 管 中 ， 置 37 ， 含 5%二 氧 化 碳 的 培 养 箱 内 自 然 沉 降 10min， 吸 取 上 层 细 胞 悬 液 于50mL离 心 管 中 ， 再 加 入 3mLRPMI1640培 养 基 重 复 洗 涤 2次 。 以 1000r/min离 心 10min， 弃 上 清 液 。 加 入 10mLRPMI1640培 养 基 重 悬 细 胞 。 将 细 胞 悬 液 10倍 稀 释 后 计 数 。B.1.5 饲 养 细 胞 的 制 备取 空 白 BALB/c小 鼠 一 只 ， 摘 取
22、 眼 球 眼 眶 放 血 ， 获 得 阴 性 血 清 ， 脱 颈 处 死 ， 置 于 75%的 酒 精 中 浸 泡 10min，无 菌 取 出 脾 脏 ， 先 用 RPMI1640培 养 基 洗 涤 2次 ， 去 除 附 着 的 结 缔 组 织 ； 再 将 脾 脏 移 入 另 一 置 有 200目 微 孔滤 网 的 RPMI1640培 养 基 中 ， 眼 科 剪 刀 剪 开 一 个 小 口 ， 用 研 磨 棒 轻 轻 挤 压 ， 释 放 脾 细 胞 ， 制 成 脾 细 胞 悬 液 ，移 至 10mL离 心 管 中 ， 置 37 ， 含 5%二 氧 化 碳 的 培 养 箱 内 自 然 沉 降 1
23、0min， 吸 取 上 层 细 胞 悬 液 于 50mL离 心管 中 ， 再 加 入 3mLRPMI1640培 养 基 重 复 洗 涤 2次 。 以 1000r/min离 心 10min， 弃 上 清 液 。 加 入 10mL RPMI1640培 养 基 重 悬 细 胞 。 B.1.6 细 胞 融 合将 一 瓶 含 20%胎 牛 血 清 、 1%HAT的 RPMI1640培 养 基 、 1mL 50% PEG1450、 放 入 37 温 箱 中 预 热 。 将 重 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 6 悬 后 的 免 疫 脾 细 胞 与 骨
24、 髓 瘤 细 胞 在 50 mL离 心 管 中 混 匀 ， 1000r/min离 心 10min， 弃 去 上 清 液 ， 用 滤 纸 将管 壁 上 残 留 的 液 体 吸 干 ， 用 手 指 尖 轻 轻 弹 管 底 ， 使 两 种 细 胞 充 分 混 匀 。 吸 取 预 热 的 PEG溶 液 0.8mL， 向 细胞 沉 淀 （ 离 心 管 置 于 37 水 浴 中 ） 缓 缓 滴 加 ， 边 滴 边 轻 轻 搅 拌 ， 在 1min内 加 完 。 静 置 30秒 ， 之 后 3min内 加 入 预 热 的 RPMI1640培 养 基 3mL， 终 止 PEG的 作 用 。 余 下 的 17m
25、L培 养 基 在 2min内 加 完 。 融 合 完 成 后 ，1000r/min离 心 10min， 弃 上 清 液 。 将 沉 淀 的 细 胞 轻 轻 悬 浮 于 20%胎 牛 血 清 、 1%HAT的 RPMI1640培 养 基 中 ，加 入 适 量 的 饲 养 细 胞 后 ， 置 于 96孔 细 胞 培 养 板 中 ， 约 200L/孔 ， 置 37 ， 含 5%二 氧 化 碳 的 培 养 箱 内 培 养 。第 五 天 补 加 1滴 HAT培 养 基 ， 第 8天 弃 去 孔 中 液 体 ， 补 加 200L HAT培 养 基 ， 待 融 合 集 落 长 至 孔 底 面 积 的 1/4
26、时 ， 取 上 清 进 行 抗 体 检 测 。B.1.7 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 筛 选用 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 HI试 验 筛 选 阳 性 杂 交 瘤 细 胞 。 将 细 胞 上 清 作 为 待 检 样 品 加 入 反 应 板 中 ， 同 时 设定 SP2/0细 胞 培 养 上 清 作 为 阴 性 对 照 ， 免 疫 小 鼠 血 清 做 为 阳 性 对 照 。 B.1.8 有 竞 争 效 果 的 细 胞 株 的 筛 选用 禽 流 感 病 毒 H7亚 型 HI试 验 筛 选 出 阳 性 血 清 1份 ， 阴 性 血 清 1份 。 将 筛 选 出 的 阳 性 血 清 和 阴 性 血
27、 清 用样 品 稀 释 液 2倍 稀 释 ， 加 入 包 被 好 的 酶 标 板 中 ， 100L/孔 ， 37 作 用 30min。 弃 去 孔 中 液 体 ， 洗 涤 5次 ，拍 干 ， 分 别 加 入 阳 性 细 胞 上 清 各 100L， 37 作 用 30min。 洗 涤 5次 ， 拍 干 ， 加 入 1:5000稀 释 的 羊 抗 鼠 IgG-HRP，每 孔 加 入 100L， 37 作 用 30min。 洗 涤 5次 ， 拍 干 ， 每 孔 加 底 物 显 色 液 100L， 室 温 显 色 15min。 每 孔 加入 50L终 止 液 ， 用 酶 标 仪 进 行 测 定 各 孔
28、 OD450nm值 。B.1.9 杂 交 瘤 细 胞 的 亚 克 隆采 用 有 限 稀 释 法 对 连 续 3次 检 测 均 为 阳 性 且 HI抗 体 效 价 高 者 进 行 亚 克 隆 。 首 先 制 备 小 鼠 饲 养 细 胞 ，铺 于 96孔 细 胞 板 中 ， 100L/孔 ； 将 阳 性 孔 中 的 杂 交 瘤 细 胞 用 培 养 基 吹 下 ， 细 胞 计 数 ， 用 有 限 稀 释 法 按 照5:3:1的 比 例 (即 96孔 板 的 前 四 排 细 胞 数 为 5个 /孔 ， 中 间 四 排 细 胞 数 为 3个 /孔 ， 最 后 四 排 细 胞 数 为 1个 /孔 )加 入
29、 96孔 板 ， 置 37 ， 含 5%二 氧 化 碳 的 培 养 箱 内 培 养 ， 第 7日 用 新 的 培 养 基 置 换 出 96孔 板 中 培 养 基 ， 以 后 每 天 观 察 ， 待 上 清 变 黄 对 出 现 单 个 细 胞 克 隆 孔 用 ELISA方 法 进 行 检 测 ； 连 续 3次 亚 克 隆 且 检 测 阳 性 者可 以 定 株 。 将 定 株 的 单 克 隆 细 胞 扩 大 至 24孔 板 ， 长 满 后 转 至 6孔 板 ， 最 后 扩 大 培 养 至 25cm2细 胞 培 养 瓶 中 ，一 部 分 冻 存 ， 每 株 杂 交 瘤 细 胞 保 存 6份 ； 一
30、部 分 扩 大 培 养 用 于 制 备 腹 水 。B.1.10 腹 水 法 制 备 单 克 隆 抗 体选 用 8周 龄 10周 龄 BALB/c雌 性 小 鼠 ， 腹 腔 注 射 灭 菌 液 体 石 蜡 ， 0.5mL/只 ； 1周 后 腹 腔 注 射 用 PBS稀释 的 处 于 对 数 生 长 期 的 杂 交 瘤 细 胞 ， 1105个 /只 ； 7日 10日 后 采 集 腹 水 ， 1200r/min离 心 10min， 去 除脂 肪 组 织 ， 吸 取 上 清 ， -70 及 以 下 保 存 备 用 。B.2 单 克 隆 抗 体 的 纯 化 及 验 证B.2.1 腹 水 单 克 隆 抗
31、体 的 纯 化将 上 述 腹 水 取 1mL， 加 入 4mLpH值 4.5醋 酸 缓 冲 液 ， 加 入 辛 酸 25L， 搅 拌 30min， 静 置 2h。 12000r/min 离 心 10min； 弃 沉 淀 ， 上 清 用 滤 纸 过 滤 后 将 pH值 调 至 7.4， 缓 慢 逐 滴 加 入 上 述 液 体 体 积 45%的 饱 和 硫 酸 铵溶 液 ， 继 续 搅 拌 30min， 在 2 8 静 置 2h； 以 12000r/min离 心 30min， 弃 上 清 。 用 原 腹 水 1/2体 积 的10mmol/LTris-HCL（ pH值 9.0） 将 沉 淀 重 悬
32、， 转 入 透 析 袋 中 ， 在 10mmol/LTris-HCL（ pH值 9.0） 中 2 8 透 析 15h。 超 微 量 核 酸 蛋 白 测 定 仪 测 定 单 克 隆 抗 体 浓 度 ， 分 装 ， -70 及 以 下 保 存 。B.2.2 单 克 隆 抗 体 的 鉴 定 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 7 B.2.3 浓 度将 纯 化 后 的 单 克 隆 抗 体 用 超 微 量 核 酸 蛋 白 测 定 仪 测 定 蛋 白 浓 度 ， 浓 度 为 4.2mg/mL。B.2.4 纯 度用 SDS-PAGE电 泳 检 测 单 抗
33、纯 度 ， 结 果 见 图 B.1。 电 泳 显 示 结 果 应 为 两 条 清 晰 的 目 的 条 带 （ 在 50KD和25KD附 近 各 有 一 条 清 晰 的 目 的 条 带 ， 分 别 为 重 链 和 轻 链 ） ， 无 其 他 杂 带 。 图 B.1 单 克 隆 抗 体 的 纯 度 鉴 定 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 8 A B附 录 C（ 资 料 性 ）胶 体 金 试 纸 条 的 制 备C.1 胶 体 金 的 制 备向 洁 净 的 锥 形 瓶 中 加 入 100mL注 射 用 水 ， 再 加 入 1mL1%氯 金 酸 溶
34、 液 （ 氯 金 酸 1g， 溶 于 100mL蒸 馏 水 中 ） ，放 于 微 波 炉 内 ， 中 火 加 热 至 沸 腾 ， 快 速 加 入 1.8mL的 1.05%柠 檬 酸 三 钠 溶 液 后 继 续 加 热 至 溶 液 颜 色 为 稳 定的 酒 红 色 ， 室 温 下 自 然 冷 却 ， 最 后 用 双 蒸 水 定 容 至 100mL， 即 为 胶 体 金 溶 液 。C.2 金 标 抗 体 的 制 备将 所 得 的 胶 体 金 用 0.2mol/L碳 酸 钾 调 节 pH值 到 9.0， 加 入 单 克 隆 抗 体 ， 每 1mL胶 体 金 溶 液 的 最 适 单 抗标 记 量 为
35、8.0ug， 缓 慢 搅 拌 45min， 得 单 克 隆 抗 体 -胶 体 金 标 记 物 ， 在 搅 拌 下 加 入 0.5mL5% PEG20000溶 液 封 闭 30min。 将 标 记 好 的 胶 体 金 溶 液 8000rpm离 心 30min后 用 10mM Tris-HCl（ pH9.0） 重 悬 。 即 获 得 金 标抗 体 。C.3 胶 体 金 结 合 垫 的 制 备C.3.1 配 制 金 垫 处 理 液 10mM Tris-HCl， 0.45%PVP-40， 0.45%Tween-20， 0.5%SDS-L+SDS-F， 3%海 藻 糖 ，搅 拌 混 匀 后 0.22uM
36、滤 器 过 滤 备 用 。C.3.2 金 垫 制 备 将 玻 璃 纤 维 素 膜 浸 泡 在 上 述 处 理 液 中 30min， 37 鼓 风 箱 中 烘 干 。 将 制 备 的 金 标 抗 体喷 涂 于 处 理 过 的 胶 体 金 结 合 垫 上 ， 喷 量 为 10uL/cm， 于 37 鼓 风 箱 中 烘 干 。C.4 硝 酸 纤 维 素 膜 的 包 被C.4.1 配 制 包 被 液 ， 0.2M Tris-HCl， 1%Tween-20， 0.5%X-100， 搅 拌 混 匀 后 0.22uM滤 器 过 滤 。C.4.2 将 单 克 隆 抗 体 和 山 羊 抗 鼠 IgG多 克 隆
37、抗 体 分 别 用 上 述 包 被 液 稀 释 后 ， 喷 涂 于 硝 酸 纤 维 素 膜 上 分 别 作 为 检 测 线 和 质 控 线 ， 其 浓 度 分 别 为 1mg/mL和 0.5mg/mL， 喷 量 为 1uL/cm,， 检 测 线 和 质 控 线 的 距 离 是 5mm， 于 37 烘 箱 中 烘 干 3h， 密 封 保 存 备 用 。C.5 样 品 垫 处 理将 吸 水 纸 浸 泡 在 PB缓 冲 液 中 30min， 37 鼓 风 箱 中 烘 干 后 裁 切 成 宽 1.6cm条 状 备 用 。C.6 试 纸 条 的 组 装将 处 理 好 的 样 品 垫 、 胶 体 金 结
38、合 垫 、 硝 酸 纤 维 素 膜 、 吸 水 垫 按 顺 序 依 次 粘 贴 在 硬 质 PVC底 板 上 ， 然后 裁 切 成 1.6mm的 条 状 ， 密 封 保 存 备 用 。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1590 FORMTEXT 2020 9 B C附 录 D（ 资 料 性 ）样 品 处 理 注 意 事 项D.1 防 止 样 品 和 环 境 污 染 措 施D.1.1 样 品 处 理 时 ， 应 在 级 生 物 安 全 柜 或 超 净 工 作 台 中 吸 出 。D.1.2 样 品 处 理 与 胶 体 金 试 纸 条 检 测 应 在 不 同 的 区 域 进 行 。
39、 胶 体 金 试 纸 条 检 测 可 在 敞 开 干 净 的 空 间 内进 行 。 操 作 区 应 有 专 门 的 固 体 和 液 体 废 弃 物 收 集 容 器 。D.1.3 废 弃 物 经 高 压 灭 菌 后 应 按 相 关 规 定 处 理 。D.2 个 人 防 护 措 施 D.2.1 样 品 处 理 及 实 验 过 程 中 应 注 意 个 人 防 护 ， 戴 口 罩 和 手 套 、 穿 工 作 服 。D.2.2 在 检 测 过 程 中 ， 使 用 样 品 处 理 与 胶 体 金 试 纸 条 检 测 操 作 区 域 后 应 及 时 清 理 物 品 ， 用 75%酒 精 或 3%过 氧 乙 酸 溶 液 消 毒 ； 级 生 物 安 全 柜 或 超 净 工 作 台 在 清 洁 消 毒 后 ， 再 用 紫 外 线 照 射 30min。_
