1、ICS 65.120CCS B 46湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 1582 202042饲 料 中 牛 、 羊 源 性 成 分 定 性 PCR 检 测 方 法 Detection of bovine, ovine, caprine derived materials in feedstuffs by qualitativepolymerase chain reaction (PCR) method 2020 -07- 07发 布 2020- 11 -07实 施湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT
2、2020 I 目 次前 言 .II1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 原 理 .15 试 剂 和 材 料 .16 仪 器 和 设 备 .2 7 分 析 步 骤 .38 结 果 分 析 .59 结 果 判 定 与 表 述 .510 PCR产 物 测 序 结 果 判 定 与 表 述 .511 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施 .512 废 弃 物 处 理 .5附 录 A（ 资 料 性 ） 扩 增 产 物 序 列 （ 来 源 NCBI） .6 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 2020
3、II 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 文 件 由 湖 北 省 农 业 农 村 厅 归 口 。本 文 件 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 、 湖 北 省 畜 禽 产 品 质 量 监 督 检 验 测 试 中 心 。本 文 件 主 要 起 草
4、人 ： 刘 榜 ， 王 文 君 ， 刘 祖 红 ， 金 秀 娥 ， 付 明 ， 周 翔 ， 梁 昱 ， 王 峻 。本 文 件 实 施 中 的 疑 问 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821， 邮 箱 ： ；华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话 ： 027-87382290， 邮 箱 ： 。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 及 建 议 请 华 中 农 业 大 学 ， 联 系 电 话 ： 027-87282038， 邮 箱 ： 。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 2020 1 饲 料
5、 中 牛 、 羊 源 性 成 分 定 性 PCR检 测 方 法1 范 围本 文 件 规 定 了 饲 料 中 除 乳 制 品 以 外 的 牛 （ 普 通 牛 、 瘤 牛 、 牦 牛 和 水 牛 ） 、 羊 （ 绵 羊 和 山 羊 ） 源 性 成分 的 定 性 PCR检 测 方 法 。本 文 件 适 用 于 饲 料 中 除 乳 制 品 以 外 的 牛 （ 普 通 牛 、 瘤 牛 、 牦 牛 和 水 牛 ） 、 羊 （ 绵 羊 和 山 羊 ） 源 性 成分 的 定 性 PCR检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成
6、本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本文 件 。GB/T 6682 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法GB/T 14699.1 饲 料 采 样GB/T 19495.2 转 基 因 产 品 检 测 实 验 室 技 术 要 求GB/T 27403-2008 实 验 室 质 量 控 制 规 范 食 品 分 子 生 物 学 检 测3 术 语 和 定 义本
7、文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义 。 4 原 理根 据 牛 、 羊 特 异 性 序 列 ， 设 计 一 对 特 异 性 引 物 ， 对 待 检 样 品 提 取 的 DNA进 行 PCR扩 增 ， 依 据 扩 增 特 异性 片 段 的 结 果 ， 判 断 待 检 样 品 中 是 否 含 有 牛 或 羊 源 性 成 分 ， 并 可 根 据 片 段 大 小 差 异 进 而 判 断 是 牛 源 性 成分 （ 125 bp） ， 还 是 羊 源 性 成 分 （ 107 bp） 。5 试 剂 和 材 料5.1 除 另 有 规 定 外 ， 试 剂 为 分 析 纯 或 生 化 试 剂 。
8、 实 验 用 水 符 合 GB/T 6682 的 要 求 。5.2 琼 脂 糖 。5.3 GelRed核 酸 染 料 。 注 ： 根 据 需 要 可 选 择 其 他 效 果 相 当 的 核 酸 染 料 作 为 核 酸 电 泳 的 染 色 剂 。5.4 10 mol/L氢 氧 化 钠 溶 液 ： 在 160 mL水 中 加 入 80.0 g 氢 氧 化 钠 （ NaOH） ， 溶 解 后 冷 却 至 室 温 ， 再加 水 定 容 至 200 mL。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 2020 2 5.5 0.5 mol/L 乙 二 铵 四 乙 酸 二
9、钠 溶 液 （ pH 8.0） ： 称 取 18.6 g 乙 二 铵 四 乙 酸 二 钠 （ EDTA-Na2） ， 加入 70 mL水 中 ， 再 加 入 适 量 氢 氧 化 钠 溶 液 （ 5.4） ， 加 热 至 完 全 溶 解 后 ， 冷 却 至 室 温 ， 用 氢 氧 化 钠 溶 液（ 5.4） 调 pH至 8.0， 加 水 定 容 至 100 mL。 在 103.4 kPa（ 121 ） 条 件 下 灭 菌 20 min。5.6 1 mol/L 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -盐 酸 溶 液 （ pH 8.0） ： 称 取 121.1 g 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tr
10、is） 溶 解于 800 mL 水 中 ， 用 盐 酸 （ HCl） 调 pH 至 8.0， 加 水 定 容 至 1 000 mL。 在 103.4 kPa（ 121 ） 条 件 下灭 菌 20 min。5.7 5 mol/L 氯 化 钠 溶 液 ： 称 取 29.22 g 氯 化 钠 （ NaCl） 溶 于 80mL水 中 ， 加 水 定 容 至 100mL。 在 103.4kPa蒸 汽 压 （ 121 ） 条 件 下 灭 菌 20 min。5.8 10%十 二 烷 基 磺 酸 钠 溶 液 ： 称 取 10 g 十 二 烷 基 磺 酸 钠 （ C 12H25SO4Na， SDS） ， 加 入
11、 80 mL 水 中 ， 加热 至 完 全 溶 解 后 ， 冷 却 至 室 温 ， 加 水 定 容 至 100mL。 在 103.4kPa 蒸 汽 压 （ 121 ） 条 件 下 灭 菌 20 min。5.9 DNA 提 取 细 胞 裂 解 液 ： 量 取 200 mL 乙 二 铵 四 乙 酸 二 钠 溶 液 （ 5.5） ， 200 mL 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -盐 酸 溶 液 （ 5.6） ， 40 mL 氯 化 钠 溶 液 （ 5.7） ， 200 mL 十 二 烷 基 磺 酸 钠 溶 液 （ 5.8） ， 混 合 后 用 水 定 容至 1 000 mL， 室 温 保 存 ，
12、备 用 。5.10 20 mg/mL 蛋 白 酶 K 溶 液 ： 将 200 mg 蛋 白 酶 K（ Proteinase K） 溶 于 9.5mL水 中 ， 轻 摇 至 完 全溶 解 后 ， 加 水 定 容 至 10 mL。 于 -20 保 存 备 用 。5.11 硼 酸 。5.12 Tris-饱 和 酚 。5.13 氯 仿 ： 异 戊 醇 (24:1)： 将 氯 仿 和 异 戊 醇 按 照 24:1的 比 例 配 制 。5.14 无 水 乙 醇 。5.15 75%乙 醇 。5.16 TE缓 冲 液 （ pH 8.0） ： 分 别 量 取 10 mL 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 -盐 酸
13、 溶 液 （ 5.6） 和 2 mL 乙 二 铵 四 乙 酸 二 钠 溶 液 （ 5.5） 溶 液 ， 加 水 定 容 至 1 000 mL。 在 103.4 kPa（ 121 ） 条 件 下 灭 菌 20 min。5.17 5 TBE缓 冲 液 ： 称 取 54 g 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris） ， 加 入 27.5 g 硼 酸 ， 先 用 500 mL水 加 热搅 拌 溶 解 后 ， 加 入 20 mL 乙 二 铵 四 乙 酸 二 钠 溶 液 （ 5.5） ， 用 10mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 （ 5.4） 调 pH 至8.0， 然 后 加 水 定 容 到 1
14、000 mL。 使 用 时 用 水 稀 释 成 0.5 TBE。5.18 Taq酶 。5.19 10 PCR缓 冲 液 。5.20 dNTP混 合 液 。5.21 6 DNA上 样 缓 冲 液 。5.22 DNA分 子 量 标 记 ： 可 清 楚 的 区 分 100bp 1 000bp 的 DNA片 段 。5.23 物 种 特 异 性 引 物 （ 表 1） 。5.24 引 物 溶 液 ： 用 TE缓 冲 液 （ 5.16） 或 水 分 别 将 引 物 稀 释 到 10mol/L。5.25 PCR产 物 回 收 试 剂 盒 。 表 1 引 物 信 息引 物 名 称 引 物 序 列 片 段 大 小
15、 /bp上 游 引 物 a 5 -ATGGCTTAGGACCCAGCTCT-3 牛 125、羊 107下 游 引 物 b 5 -ACARa)CCAGAACCTGGATCGGA-3a R=A/G, 简 并 碱 基 。6 仪 器 和 设 备 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 2020 3 6.1 分 析 天 平 ： 感 量 不 小 于 0.1mg。6.2 PCR扩 增 仪 ： 升 降 温 速 度 1.5 /s， 孔 间 温 度 差 异 1.0 。6.3 电 泳 槽 、 电 泳 仪 等 电 泳 装 置 。6.4 紫 外 透 射 仪 。6.5 紫 外 分 光
16、 光 度 计 。6.6 凝 胶 成 像 系 统 或 照 相 系 统 。6.7 微 量 可 调 移 液 器 ： 0.1 L 2.5 L， 1 L 10 L， 10 L 100 L， 100 L 1 000 L。6.8 涡 旋 振 荡 器 。6.9 离 心 机 （ 最 大 离 心 力 12 000 g） 。6.10 恒 温 水 浴 锅 。7 分 析 步 骤 7.1 样 品 采 集 与 制 备按 照 GB/T 14699.1采 样 ， 粉 碎 并 充 分 混 合 均 匀 后 ， -20 保 存 备 用 。7.2 DNA模 板 制 备7.2.1 试 样 DNA提 取试 样 DNA提 取 步 骤 如 下
17、 ：a) 样 品 颗 粒 100目 时 最 少 称 取 0.05 g， 60目 时 最 少 称 取 0.1 g， 20 目 时 最 少 称 取 0.2 g；b) 称 取 样 品 于 2 mL离 心 管 中 ， 加 入 1 mL 细 胞 裂 解 液 （ 5.9） ， 然 后 加 入 30 L 蛋 白 酶 K（ 5.10）溶 液 ， 混 匀 ， 56 消 化 6 h 10 h 至 无 明 显 组 织 块 ， 4 ， 12 000 g 离 心 10 min， 取 上 清 移至 新 的 2 mL离 心 管 中 ；c) 加 入 等 体 积 的 Tris-饱 和 酚 （ 5.12） ， 缓 慢 颠 倒 混
18、 匀 10 min， 4 ， 12 000 g 离 心 10 min，取 上 清 液 移 至 新 的 2 mL 离 心 管 中 ； d) 加 入 0.5倍 体 积 的 Tris-饱 和 酚 （ 5.12） 和 0.5倍 体 积 的 氯 仿 ： 异 戊 醇 （ 24:1） （ 5.13） ， 缓慢 颠 倒 混 匀 10 min， 4 ， 12 000 g 离 心 10 min；e) 取 上 清 液 移 至 新 的 2 mL 离 心 管 中 ， 加 入 等 体 积 的 氯 仿 ： 异 戊 醇 （ 24:1） （ 5.13） ， 缓 慢 颠 倒混 匀 10 min， 4 ， 12 000 g 离 心
19、 5 min；f) 多 次 重 复 操 作 步 骤 e)， 直 到 两 相 中 间 不 能 看 到 明 显 的 变 性 蛋 白 质 为 止 ， 取 上 清 液 移 至 新 的 4mL离 心 管 中 ；g) 加 入 2倍 体 积 -20 预 冷 的 无 水 乙 醇 （ 5.14） ， 轻 轻 摇 晃 至 絮 状 沉 淀 析 出 ， 12 000g 离 心 5 min10 min， 倒 掉 上 清 液 ；h) 加 入 1 mL 75%乙 醇 （ 5.15） 洗 涤 沉 淀 ， 12 000 g 离 心 3 min， 吸 去 上 清 液 ， 重 复 1 次 2次 ；i) 室 温 下 放 置 使 残
20、余 乙 醇 完 全 挥 发 ， 加 入 30 L 50L TE缓 冲 液 （ 5.16） 溶 解 DNA沉 淀 ， -20 保 存 DNA溶 液 。7.2.2 DNA质 量 评 估 使 用 紫 外 分 光 光 度 计 对 试 样 DNA的 质 量 进 行 评 估 ， 检 测 260 nm和 280 nm处 的 吸 光 值 A260和 A280， 满足 以 下 要 求 则 适 宜 进 行 PCR扩 增 ：a) DNA浓 度 为 50 ng/L 1 000 ng/L；b) A260/A280比 值 应 在 1.8 2.0之 间 。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FOR
21、MTEXT 2020 4 7.3 PCR反 应7.3.1 试 样 PCR 反 应7.3.1.1 每 个 试 样 PCR反 应 设 置 3 个 平 行 。7.3.1.2 在 PCR 反 应 管 中 按 表 2依 次 加 入 反 应 试 剂 ， 混 匀 。 也 可 采 用 经 验 证 的 、 等 效 的 定 性 PCR 反 应试 剂 盒 配 制 反 应 体 系 。7.3.1.3 将 PCR 管 放 入 离 心 机 中 ， 2 000 g 离 心 1 min， 取 出 PCR管 后 ， 放 入 PCR仪 中 。7.3.1.4 进 行 PCR反 应 。 反 应 程 序 为 ： 95 预 变 性 5mi
22、n； 95 变 性 30s， 62 退 火 30s， 72延 伸 15s， 共 进 行 35次 循 环 ； 72 延 伸 3min； 4 降 温 2 min。7.3.1.5 反 应 结 束 后 取 出 PCR 管 ， 对 PCR反 应 产 物 进 行 电 泳 检 测 。表 2 PCR检 测 反 应 体 系 试 剂 用 量 /L 终 浓 度双 蒸 水 13.510 Buffer 2 1dNTPs 混 合 液 （ 各 2.5 mmol/L） 1.6 各 0.2 mmol/L5 U/L Taq酶 0.1 0.025 U/L10 mol/L 上 游 引 物 0.4 0.2 mol/L10 mol/L
23、下 游 引 物 0.4 0.2 mol/L25 ng/L DNA模 板 2.0 2.5 ng/L 总 体 积 20.0注 ： 若 采 用 定 性 PCR试 剂 盒 ， 则 按 试 剂 盒 说 明 书 的 推 荐 用 量 配 制 反 应 体 系 ， 但 正 向 引 物 和 反 向 引 物 用 量 按 表 2执 行 。7.3.2 对 照 PCR 反 应在 试 样 PCR反 应 的 同 时 ， 应 设 置 阴 性 对 照 、 阳 性 对 照 和 空 白 对 照 。分 别 以 牛 和 羊 的 基 因 组 DNA作 为 阳 性 对 照 ； 以 除 上 述 目 标 物 种 以 外 的 常 见 动 物 的
24、基 因 组 DNA作 为 阴 性对 照 ； 以 水 作 为 空 白 对 照 。各 对 照 PCR反 应 体 系 中 ， 除 模 板 外 ， 其 余 组 分 及 PCR反 应 条 件 与 试 样 PCR（ 7.3.1） 相 同 。7.4 PCR产 物 电 泳 检 测称 量 琼 脂 糖 （ 5.2） 适 量 ， 加 入 0.5 TBE缓 冲 液 （ 5.17） 至 终 浓 度 为 25 g/L， 加 热 溶 解 ， 配 制 成 琼脂 糖 溶 液 。 每 100mL琼 脂 糖 溶 液 中 加 入 5L GelRed核 酸 染 料 （ 5.3） ， 混 匀 ， 稍 适 冷 却 后 ， 将 其 倒 入
25、电 泳 板 上 ， 插 上 梳 板 ， 室 温 下 凝 固 成 凝 胶 后 ， 放 入 含 0.5 TBE缓 冲 液 （ 5.17） 电 泳 槽 中 ， 垂 直 向 上 轻 轻拔 去 梳 板 。 取 5 L PCR 产 物 与 1 L 6 DNA 上 样 缓 冲 液 （ 5.21） ， 混 合 后 加 入 凝 胶 点 样 孔 ， 同 时 在 其中 一 个 点 样 孔 中 加 入 DNA分 子 量 标 记 （ 5.22） ， 接 通 电 源 ， 在 2V/cm 5V/cm条 件 下 电 泳 检 测 。7.5 凝 胶 成 像 分 析电 泳 结 束 后 ， 取 出 琼 脂 糖 凝 胶 ， 置 于 凝
26、 胶 成 像 仪 上 成 像 。 根 据 DNA分 子 量 标 记 判 断 扩 增 目 的 条 带 的片 段 大 小 （ 表 1） ， 将 电 泳 结 果 形 成 电 子 文 件 存 档 。 如 需 通 过 序 列 分 析 确 认 PCR扩 增 片 段 是 否 为 目 的 DNA片 段 ， 按 照 7.6和 7.7的 规 定 执 行 。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT 1582 FORMTEXT 2020 5 7.6 PCR产 物 回 收按 PCR产 物 回 收 试 剂 盒 说 明 书 ， 回 收 PCR扩 增 的 DNA片 段 。7.7 PCR产 物 测 序 验 证将 回
27、收 的 PCR产 物 进 行 双 向 测 序 ， PCR扩 增 引 物 作 为 测 序 引 物 ， 测 序 原 理 同 Sanger测 序 法 。 将 获 得 的序 列 分 别 与 牛 源 性 成 分 的 PCR扩 增 产 物 序 列 和 羊 源 性 成 分 的 PCR扩 增 产 物 序 列 (附 录 A)进 行 比 对 和 结 果 判定 。8 结 果 分 析阳 性 对 照 的 PCR反 应 中 可 扩 增 出 与 预 期 大 小 一 致 的 DNA片 段 （ 分 别 为 牛 125 bp、 羊 107 bp） ， 而 阴 性对 照 及 空 白 对 照 中 均 未 扩 增 出 预 期 DNA片
28、 段 ， 表 明 PCR反 应 体 系 正 常 工 作 ， 否 则 重 新 检 测 。 9 结 果 判 定 与 表 述9.1 阳 性 结 果 判 定 与 表 述 包 括 ：a) 试 样 中 牛 的 特 异 性 DNA序 列 得 到 扩 增 ， 且 扩 增 片 段 大 小 与 牛 阳 性 对 照 的 125 bp 大 小 一 致 ， 表明 样 品 中 检 测 出 牛 源 性 成 分 ， 表 述 为 “ 样 品 中 检 测 出 牛 源 性 成 分 ， 结 果 为 阳 性 ” ；b) 试 样 中 羊 的 特 异 性 DNA序 列 得 到 扩 增 ， 且 扩 增 片 段 大 小 与 羊 阳 性 对 照
29、 的 107 bp 大 小 一 致 ， 表明 样 品 中 检 测 出 羊 源 性 成 分 ， 表 述 为 “ 样 品 中 检 测 出 羊 源 性 成 分 ， 结 果 为 阳 性 ” 。9.2 阴 性 结 果 判 定 与 表 述 包 括 ：a) 试 样 中 牛 的 特 异 性 DNA序 列 未 得 到 扩 增 ， 或 扩 增 片 段 大 小 与 牛 阳 性 对 照 的 125 bp大 小 不 一 致 ，表 明 样 品 中 未 检 测 出 牛 源 性 成 分 ， 表 述 为 “ 样 品 中 未 检 测 出 牛 源 性 成 分 ， 结 果 为 阴 性 ” ；b) 试 样 中 羊 的 特 异 性 DN
30、A序 列 未 得 到 扩 增 ， 或 扩 增 片 段 大 小 与 羊 阳 性 对 照 的 107 bp大 小 不 一 致 ，表 明 样 品 中 未 检 测 出 羊 源 性 成 分 ， 表 述 为 “ 样 品 中 未 检 测 出 羊 源 性 成 分 ， 结 果 为 阴 性 ” 。 注 ： 3个 PCR平 行 扩 增 的 结 果 不 一 致 的 ， 应 重 复 检 测 。 重 复 检 测 结 果 仍 不 一 致 的 ， 以 多 数 结 果 为 最 终 结 果 。10 PCR产 物 测 序 结 果 判 定 与 表 述若 测 序 结 果 与 附 录 A中 对 应 物 种 的 PCR扩 增 产 物 序
31、列 的 符 合 程 度 在 90%以 上 （ 含 90%） ， 则 确 证 为 含 有对 应 物 种 源 性 成 分 ； 若 结 果 符 合 程 度 在 90%以 下 ， 则 确 证 为 不 含 有 对 应 物 种 源 性 成 分 。11 检 测 过 程 中 防 止 交 叉 污 染 的 措 施按 照 GB/T 27403-2008中 附 录 D的 规 定 执 行 。12 废 弃 物 处 理 检 测 过 程 中 的 废 弃 物 ， 收 集 后 按 照 GB/T 19495.2规 定 的 废 弃 物 处 理 要 求 进 行 无 害 化 处 理 。 FORMTEXT DB42/T FORMTEXT
32、1582 FORMTEXT 2020 6 A A附 录 A（ 资 料 性 ）扩 增 产 物 序 列 （ 来 源 NCBI）A.1 牛 源 性 成 分 的 PCR扩 增 产 物 序 列 （ 125 bp） ：1 ATGGCTTAGG ACCCAGCTCT GCAGCCATGG TTCGGGGCCT TGAGCTTCCC AGGTGTGCAG61 CTGCTGATGG TGGATTGGCA CTGATCCGGG TGGTGTGGTG TGGTTCCGAT CCAGGTTCTG151 GTTGTA.2 羊 源 性 成 分 的 PCR扩 增 产 物 序 列 （ 107 bp） ：1 ATGGCTTAGG ACCCAGCTCT GCAGCCATGG TTTGGGGCCT GGAGATTCCC AGGTTTGCAG 61 CTGCTGATGG TGGATTGGTG TGTGGTTCCG ATCCAGGTTC TGGCTGT注 ： 划 线 部 分 为 引 物 序 列 所 在 位 置 。
