1、 ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省 地方标准 DB 37/T 4362 2021 流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光 RT-PCR 检 测方法 Duplex real-time RT-PCR detection method for influenza virus and canine distemper virus 2021 - 03 - 11 发布 2021 - 04 - 11 实施 山东省 市场监督管理局 发 布 DB 37/T 4362 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分： 标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注
2、意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本文件由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心、中华人民共和国北京海关检科院、威海市畜牧 业发展中心、山东省畜牧总站、青岛市动物疫病预防控制中心、淄博市张店区畜牧事业服务中心、山东 农业大学。 本文件主要起草人：王贵升、张鹤晓、赵国清、尹斐斐、徐鸿、宋德武、薛瑞雪、李玉杰、杨景晁、 孙淑红、马慧玲、张华杰、兰邹 然。 DB 37/T 4362 2021 1 流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了水貂
3、、狐狸和貉流感病毒与犬瘟热病毒双重荧光 RT-PCR检测方法。 本文件适用于水貂、狐狸和貉流感病毒与犬瘟热病毒的快速鉴别诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：逆转录聚合酶链
4、式反应 RNA：核糖核酸 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水 5 试剂或材料 5.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 要求。所用液体试剂均需 使用无 RNA酶的容器进行分装。 5.2 TRIzol，应 2 8 保存。 5.3 0.1 % DEPC水。 5.4 氯仿， 4 预冷。 5.5 异丙醇， 4 预冷。 5.6 75 % 乙醇，配置见 A.3，应 -20 预冷。 5.7 TE 缓冲液，配制见 A.4。 5.8 阳性、阴性对照。 阳性对照：带有流感病毒 M 基因和犬瘟热病毒 N基因的质粒。 阴性对照：为已知流感病毒和犬瘟热病毒阴性的动物组织悬液。 DB 37
5、/T 4362 2021 2 6 仪器设备 6.1 双通道以上荧光 PCR检测仪及配套反应管（板）。 6.2 高速冷冻离心机，最高转速应不低于 13 000 r/min。 6.3 冰箱， 2 8 和 -20 两种。 6.4 微量移液器及配套吸头，量程规格应包含 5 L、 10 L、 100 L和 1 000 L。 6.5 1.5 mL离心管，应无核酸酶。 7 样品 7.1 采样工具 下列采样工具必须经 121 ， 15 min高压灭菌 并烘干： 棉拭子； 剪刀、镊子； 1.5 mL离心管； 研钵或组织研磨仪。 7.2 样品采集 7.2.1 拭子样品 有咽喉拭子样品和肛门拭子样品： a) 咽喉拭
6、子采样，采样时将拭子深入喉头来回刮 3次 5次取咽喉分泌液。然后将拭子插入装有 1.0 mL PBS的 1.5 mL 离心管中，加盖、编号备用； b) 肛门拭子采样，采样时将拭子深入肛门转一圈并沾取少量粪便；然后将拭子插入装有 1.0 mL PBS的 1.5 mL离心管中，加盖、编号备用。 7.2.2 组织样品 用无菌剪刀、镊子采集不少于 2.0 g的肺脏等组织脏器，装入一次性自封袋或其它灭菌容器，编号 备用 。 7.3 样品贮运 样品采集后，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个自封袋），于保温箱中加冰、密封， 24 h内送实验室。 7.4 样品处理 7.4.1 拭子样品 样品在混匀器
7、上充分混匀后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置 30 min，取上清液转 入无菌的离心管中，编号备用。 7.4.2 组织样品 取待检样品，不少于 2.0 g，用洁净、灭菌并烘干的研钵 充分研磨，加 10 mL PBS混匀， 4 ， 3 000 r/min 离心 15 min，取上清液转入无菌的 1.5 mL离心管中，编号备用。 或者用专用仪器设备处理待检组织样品。 DB 37/T 4362 2021 3 7.5 样品贮存 制备的样品在 2 8 条件下保存不应超过 24 h，若长期保存应置 -70 以下，应避免反复冻融（冻 融不超过三次）。 7.6 其它样品说明 急性感染且出现病毒血症
8、的动物可采集全血分离血清或血浆进行检测。 8 实验步骤 8.1 实验室规范 荧光 RT-PCR 检测方法的实验室规范应符合 GB 19489和 GB/T 27401要求，整个实验过程中均须使用 无 RNA酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须 250 干烤 4 h以上，以彻底去除 RNA酶。 8.2 样品病毒核酸 RNA 提取 所提取物为血清 、血液、细胞培养液、鸡胚尿囊液和动物组织等中的 病毒。 操作者必须戴 口罩和一 次性手套，尽量在人少时进行，防止空气中 RNA酶的污染。所用一切物品也应是无 RNA酶的。 8.2.1 在 1.5 mL的离心管中加入样品上清液 200 L，再加入 TRIz
9、ol 1 mL，充分混匀，室温放置 10 min。 8.2.2 加入 200 L的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象）， 室温放置 10 min。 8.2.3 4 离心、 13 000 r/min、 15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 8.2.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 8.2.5 离心 4 、 13 000 r/min、 15 min，用移液器 小心吸去所有上清。 8.2.6 加 1.0 mL 75 %乙醇洗一遍，离心 4 、 8 000 r/min、 10 min，用移液器 小心吸去
10、 所有上清，重 复此步骤 ,在超净台中干燥 5 min。 8.2.7 加入 50 LTE 缓冲液溶解 RNA， -20 保存备用。 8.2.8 可采用经验证的病毒 RNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 RNA。 8.3 双重荧光 RT-PCR 扩增 8.3.1 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行。设所需 PCR管数为 n（ n=样本数 +1管阴性对照 +2管阳性对照），每个测试 反应体系需要 20 L荧光 RT-PCR反应液。按 B.2配制反应液，为避免移液器取样损失，建议按 n+1个反应 配制，计算好各试剂的使用量，加入一 适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个 PCR管中各分装 2
11、0 L， 转移至样品处理区 8.3.2 加样 在样品处理区进行。分别向上述 PCR管中加入样本核酸提取 步骤 8.2.7中制备的 RNA溶液各 5 L，盖 紧管盖， 500 r/min 离心 30秒，转移至检测区。 8.3.3 荧光 RT-PCR 反应 在检测区进行。将加样后的 PCR管放入荧光 PCR检测仪内，作好标记。反应参数设置：第一阶段，反 转录 42 /15 min；第二阶段，预变性 94 /3 min；第三阶段， 94 /15 sec， 55 /10 sec， 60 /30 sec 共 40个循环。最后 40 2 min。荧光收集在第三阶段每次循环的 60 延伸时进行。 DB 37
12、/T 4362 2021 4 9 结果判定 9.1 结果分析条件的设定 阈值设定原则 ： 根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。 对于多通道荧光 PCR仪，选定 FAM检测通道读取流感病毒检测结果，选定 Cy5检测通道读取犬瘟热病毒检 测结果，淬 灭基团选无荧光基团。 9.2 质控标准 9.2.1 阴性对照无 Ct值并且无扩增曲线。 9.2.2 阳性对照的 Ct值应小于等于 28，并出现典型的 扩增曲线，曲线图样见 附录 C。 9.2.3 如阴性和阳性对照不 满足以上条件，此次实验视为无效。 注： Ct值，每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环
13、数。 9.3 结果判定 9.3.1 阴性 双检测通道均无 Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品中无禽流感、犬瘟热病毒核酸。 9.3.2 阳性 9.3.2.1 双阳性：双检测通道 Ct 值均 30.0，且均出现典型的扩增曲线，表示样本中存在流感病毒和 犬瘟热病毒的核酸。 9.3.2.2 单阳性： 如仅 FAM检测通道出现特征性扩增曲线 ，且 Ct 值 30.0，而 Cy5检测通道无 Ct值并且无扩 增曲线，表示样本中存在流感病毒核酸； 如仅 Cy5检测通道出现特征性扩增曲线，且 Ct 值 30.0，而 FAM检测通道无 Ct值并且无扩 增曲线，表示样本中存在犬瘟热病毒核酸。 9.3.3 可疑 任
14、一通道 Ct值在 30.0 38.0区间，且出现典型的扩增曲线的样品，建议复验。复验仍出现上述结果 的，判为阳性，否则判为阴性。 DB 37/T 4362 2021 5 A A 附录 A （资料 性） 溶液配制 A.1 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液 称取 6.055 g Tris置于 100 mL烧杯中，加入 80 mL 0.1 %DEPC水，用浓 HCl调节 pH值至 8.0，定容至 100 mL，高压灭菌后室温保存待用。 A.2 0.5 mol/L EDTA（ pH 8.0）溶液 称取 18.61 g Na2EDTA 2H2O置于 100 mL烧杯中，加入 80
15、 mL 0.1 %DEPC水，用 10 %的 NaOH溶液，调节 pH值至 8.0，定容至 100 mL，高压灭菌后室温保存待用。 A.3 75 % 乙醇 量取 75 mL无水乙醇，加入 25 mL 0.1 %DEPC水。 A.4 TE 缓冲液 将 0.5 mL的 10 mmol Tris-HCl(pH8.0)、 0.1 mL的 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)加入到容量瓶中，调 pH8.0， 加 0.1 %DEPC水定容至 50 mL，高压灭菌后，降至室温， 4 保存备用。 DB 37/T 4362 2021 6 B B 附录 B （资料性） 引物探针序列及荧光 RT-PCR 反应
16、液配方 B.1 引物和探针 引物和探针序列表见表 B.1。 表 B.1 引物和探针序列表 病毒名称 序列名称 序列 流感病毒 上游引物 ACCAGTCAACAAACTCCACAG 下游引物 GATTTGTTGCACACAGCATTCC 探针 FAM-GATTTGTTGCACACAGCATTCC-BHQ 犬瘟热病毒 上游引物 GCAAGCGAGGATTGAGGGTAT 下游引物 GGCCTATGGGACACACTCAAA 探针 Cy5-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQ B.2 荧光 RT-PCR 反应液配方 荧光 RT-PCR反应液配方见表 B.2。 表 B.2 荧光
17、RT-PCR 反应液配方 组分 1 个检测体系的加入量 5 RT 缓冲液 5.0 L M-MLV 反转录酶 (200 U/L ) 0.5 L dNTPs(10 mmol/L) 1.0 L MgCl2(25 mmol/L) 3.0 L 流感病毒上游引物 (10 mol/L) 0.5 L 流感病毒下游引物 (10 mol/L) 0.5 L 流感病毒探针 (10 mol/L) 0.5 L 犬瘟热病毒上游引物 (10 mol/L) 0.5 L 犬瘟热病毒下游引物 (10 mol/L) 0.5 L 犬瘟热病毒探针 (10 mol/L) 0.5 L RNA 酶抑制剂 (40 U/L) 0.25 L Ex Taq HS 酶 (40 U/L) 0.25 L DEPC 水 7.0 L 合计 20 L DB 37/T 4362 2021 7 C C 附录 C （资料性） 对照样品检测结果曲线图 流感病 毒阳性对照检测结果曲线图见图 C.1。 图 C.1 流感病 毒 阳性 对照 曲线图 犬瘟热病毒阳性对照检测结果曲线图见图 C.2。 图 C.2 犬瘟热病 毒 阳性 对照曲线图
