1、 ICS 65.020.20 CCS B 05 山东省 地方标准 DB37/T 3690.4 2020 37 液体菌种制备技术规程 第 4 部分：灵芝 Technical specifications for the preparation of liquid spawn Part 4： Ganoderma lingzhi 2020-12-04 发布 2021-01-01 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 3690.4 2020 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 基本要求 . 2 4.1 工作人员卫生要求 .
2、2 4.2 场所要求 . 2 4.3 生产车间要求 . 2 5 设施设备 . 2 5.1 基本设施 . 2 5.2 基本设备与用具 . 2 6 生产技术 . 3 6.1 工艺流程 . 3 6.2 培养基 . 3 6.3 母种制作 . 3 6.4 摇瓶菌种制作 . 3 6.5 发酵罐液体菌种制作 . 4 7 贮存 . 6 8 生产档 案 . 6 附录 A（规范性） 灵芝液体菌种生产记录事项 . 7 DB37/T 3690.4 2020 II 前 言 本文 件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件是 DB37/T 3690液体菌
3、种制备技术规程的第 4部分。 DB37/T 3690已经发布了以下部分： 第 1 部分：香菇； 第 2 部分：黑木耳； 第 3 部分：平菇； 第 4 部分：灵芝。 请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本文件由山东省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：山东省农业技术推广总站、泰安市农业科学研究院、菏泽市定陶区特色农产品服 务中心、菏泽市定陶区茗嘉兴农作物种植专业合作社。 本文件主要起草人：高霞、王庆武、赵淑芳、崔晓、高中强、高瑞杰、 孙振福、丛倩倩、马化彬、 李秀梅、司元明、唐丽娜、张燕、兰玉菲、安秀荣。
4、 DB37/T 3690.4 2020 1 液体菌种制备技术规程 第 4 部分：灵芝 1 范围 本文件规定了灵芝液体菌种制备的术语和定义、基本要求、设施设备、生产技术、贮存和生产档案 等技术要求。 本文件适用于灵芝液体菌种的制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 150.1 压力容器 第 1部分：通用要求 GB 4789.28 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T
5、12728 食用菌术语 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1742 食用菌菌种通用技术要求 3 术语和定义 GB/T 12728界定的术语和定义适用于本文件。 3.1 食用菌液体菌种发酵罐 edible mushroom liquid spawn fermenter 进行食用菌液体菌种培养的专用发酵 设备，是利用生物发酵原理，给菌丝生长提供最佳的营养、酸 碱度、温度、供氧量等生长条件，使菌丝快速生长，迅速扩繁，在短时间达到一定菌球数量的专用容器。 3.2 罐压 jar pressure 在液体菌种发酵制备过程中发酵罐内保持的空气压力（表压）
6、。 注： 单位为 MPa。 3.3 通气量 ventilation volume 在液体菌种培养过程中发酵罐 体积与每分钟通入发酵罐中无菌空气体积的比例。 注： 用 V/V（发酵罐体积 /通入空气体积）表示。 3.4 接种量 inoculation amount 液体菌种体积与培养基体积的比例。 注： 用百分数表示。 DB37/T 3690.4 2020 2 3.5 液体菌种菌龄 period of liquid spawn running 液体菌种接入培养基开始计算的液体菌种培养时间。 3.6 发酵罐空消 empty fermenter sterilization 对尚未加水投料的空发酵罐进
7、行高压灭菌。 3.7 发酵罐实消 fermenter sterilization 对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 3.8 空气过滤器 air filter 能对食用菌液体菌种发酵罐所用空气进行滤除杂菌和其他杂质，达到无菌洁净要求的设备。 3.9 摇瓶液体菌种 liquid spawn in shake flask 装至玻璃菌种瓶内在磁力搅拌器或恒温摇床上培养的液体菌种。 3.10 终止 pH initial pH value of medium 液体菌种达到放灌指标时的培养基 pH。 4 基本要求 4.1 工作人员卫生要求 工作人员应保持个人卫生，进生产车间前须洗手、消毒，应穿戴经消毒处理
8、的工作服、口罩、鞋、 帽等。 4.2 场所要求 应符合 NY/T 528的环境卫生要求，场地开阔、路面硬化。 4.3 生产车间要求 4.3.1 厂房设置和布局应符合 NY/T 528 的要求，增设摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室。 4.3.2 车间设计应符合 GB 50073 的要求。车间地面应能防水、防渗漏、防滑、防腐蚀、易清洗，排水 通畅；墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。 4.3.3 车间内设有更衣室、洗手、消毒和干手设施，安装换气设备。过道应设置风淋室。 4.3.4 车间设封闭式废物桶。 5 设施设备 5.1 基本设施 培养基配制室、摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室规模要配套，
9、布局合理，摇瓶菌种培养室、发 酵 罐菌种培养室要有调温设施，其中培养基配制室空间洁净度应达到万级以上。菌种检验室和母种制作 室要有相应的实验检测设备和制种用的灭菌设施。 5.2 基本设备与用具 DB37/T 3690.4 2020 3 液体菌种发酵罐、空气压缩机、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床或磁力搅拌器、超净工作台、摇瓶（或 三角烧瓶）、显微镜、电子秤等设备及常规用具。其中液体菌种发酵罐、高压蒸汽灭菌 锅应符合 GB 150.1 的要求，并经有关部门检验合格。应具有备用电源。 6 生产技术 6.1 工艺流程 工艺流程见图 1。 图 1 灵芝液体菌种生产工艺流程 6.2 培养基 6.2.1 母种培养
10、基 马铃薯 200 g/L（去皮煮汁）、麦麸 40 g/L（煮汁）、葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 3 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、 硫酸镁 0.5 g/L、琼脂 20 g/L， pH自然。 6.2.2 液体菌种培养基 6.2.2.1 摇瓶菌种培养基 葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 3 g/L、牛肉膏 3 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、维生素 B1 5 mg/L， pH自然。 6.2.2.2 发酵菌种培养基 宜选用以下配方，且生产用水应符合 GB 5749的要求： a) 配方 1：葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 3 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L
11、、维生素 B1 5 mg/L、 消泡剂 0.3 g/L， pH 自然； b) 配方 2：玉米粉 15 g/L、葡萄糖 20 g/L、酵母粉 2 g/L、磷酸二氢钾 2 g/L、硫酸镁 1 g/L、消 泡剂 0.3 g/L， pH 自然； c) 配方 3：淀粉 10 g/L、玉米粉 10 g/L、牛肉膏 3 g/L、蛋白胨 3 g/L、磷酸二氢钾 2 g/L、硫酸 镁 1 g/L、消泡剂 0.3 g/L， pH 自然。 6.3 母种制作 母种制作应符合 NY/T 528的要求，母种质量应符合 NY/T 1742的要求。 6.4 摇瓶菌种制作 DB37/T 3690.4 2020 4 6.4.1
12、培养基配制 按液体培养基配方，称取原料，加水搅拌至完全溶解，定容。 6.4.2 装瓶灭菌 将液体培养基装入摇瓶中，装液量为摇瓶容量的 50 % 60 %，聚丙烯薄膜或瓶塞封口。高压蒸汽灭 菌， 0.11 MPa 0.13 MPa恒压维持 20 min 30 min。 6.4.3 接种培养 液体培养基冷却至室温，无菌条件下，挑取 7 8块（ 2 3） mm（ 2 3） mm的母种菌块接入摇瓶 内，避光静置 24 h后置于恒温摇床或磁力搅拌器上， 25 28 、 140 r/min 160 r/min，培养 4 d 6 d。 6.4.4 摇瓶菌种要求 菌种外观澄清透明不浑浊，无杂菌、无异味；菌丝体
13、密集、均匀悬浮于液体中不分层，菌丝体湿重 不 少于 50 mg/mL。 6.5 发酵罐液体菌种制作 6.5.1 发酵罐空消 发酵罐初次使用、出现杂菌、长期置放、更换品种等情况出现其一时，应进行空消。蒸汽压力 0.14 MPa维持 40 min。 6.5.2 培养基配制 按液体培养基配方，称取原料，加水搅拌至完全溶解，定容。 6.5.3 上罐 打开罐盖，将液体培养基加入罐内，装液量为发酵罐容量的 70 % 80 %。通入空气搅拌 1 min 2 min， 混合均匀，密封盖口。 6.5.4 发酵罐实消 发酵罐夹套注入清水，水位低于排水口 20 cm，开启加热棒电源，待夹套压力达到 0.05 MPa
14、时缓慢打 开排气阀降压至 0 MPa，关闭排气阀继续升压至 0.13 MPa 0.14 MPa；同时，待发酵罐罐内压力达到 0.05 MPa时缓慢打开排气阀降压至 0 MPa，关闭排气阀继续升压至 0.11 MPa 0.12 MPa，微开排气阀和气 调器，同时打开空气过滤器，维持灭菌 50 min 60 min。 6.5.5 冷却 灭菌结束，关闭加热棒电源、空气过滤器灭菌阀门，缓慢打开夹套排气阀降压至 0 MPa，立即注入 冷水降温；同时缓慢打开罐内排气阀降压，待压力接近 0.05 MPa时通入无菌空气，关闭排气阀，并用 75 % 酒精棉 球封堵排气阀阀口，调节气调器维持罐压 0.03 MPa
15、 0.05 MPa，待液体培养基降温至 28 ，关闭 夹套进水阀停止冷却。 6.5.6 接种 DB37/T 3690.4 2020 5 接种口用 95 %酒精棉球擦拭灼烧，在火焰圈保护下，去掉摇瓶接种管上的保护物，将接种管套在接 种口上，撤掉火焰圈，调节气调器，将罐压降至 0.01 MPa，打开接种口阀门注入摇瓶菌种，接种量为发 酵罐装液量的 0.5 % 1.0 %，关闭接种口，塞上 75 %酒精棉球，继续通入无菌空气。 6.5.7 发酵培养 根据菌丝生长情况，适时调节进气量，通入适量无菌空气，通气量为 1： 0.8 1： 1；同时调节气调 器，维持罐压 0.02 MPa 0.03 MPa，培
16、养温度 25 28 ，培养 5 d 7 d。 6.5.8 发酵罐液体菌种质量要求 6.5.8.1 感官要求 感官指标要求应符合表 1的规定。 表 1 发酵罐液体菌种感官要求 项 目 要 求 菌液色泽 菌丝体呈白色，滤液呈淡黄色 菌液气味 有灵芝液体菌种培养时特有的气味，无异味 菌液形态 菌液澄清透明不浑浊，稍粘稠；菌丝体密集、均匀悬浮于液体中不分层 菌种微观 菌丝粗壮、分枝密度高、有隔膜，可见锁状联合，无杂菌 6.5.8.2 理化性状 理化指标应符合表 2的规定。 表 2 发酵罐液体菌种理化指标 项 目 要 求 终止 pH 3.6 5.5 菌丝体湿重（ mg/mL） 50 6.5.9 液体菌种
17、检测 6.5.9.1 形态学观察 通过肉眼及显微镜观察菌丝体形态。 6.5.9.2 霉菌检验 无菌条件下从取样口取少量菌液，接 种于 GB 4789.28中规定的 PDA培养基中，置于 28 30 恒温 培养 48 h，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况和有无霉菌污染，必要时进行水封片镜检。 6.5.9.3 细菌检验 无菌条件下从取样口取少量菌液，接种于 GB 4789.28中规定的营养肉汤培养基中，置于 30 37 恒温培养 24 h 48 h，观察是否有细菌污染，必要时进行镜检和划线培养检 验。 DB37/T 3690.4 2020 6 6.5.9.4 pH 测定 取样用 pH计或 pH试纸
18、测定菌液酸碱度。 6.5.9.5 菌丝体湿重测定 取一定体积的样品，经 10 000 r/min离心 5 min，称其湿重。 7 贮存 液体菌种生产后应及时使用。如不能及时使用，发酵罐内需持续通无菌空气，保持罐压 0.02 MPa 0.03 MPa，常温下贮存时间不超过 2 d。 8 生产档案 母种、摇瓶液体菌种和发酵罐液 体菌种生产中的每个环节由操作技术人员现场详细记录，记录内容 应按附录 A执行，签字后归档保存。档 案应保存至本批次液体菌种栽培出第一潮芝。 DB37/T 3690.4 2020 7 附录 A （规范性） 灵芝液体菌种生产记录事项 灵芝液体菌种生产记录事项如下： a) 生产投入品使用情况（包括液体菌种的制作培养基质、营养辅料、所用菌种、菌瓶）： 1) 名称； 2) 来源； 3) 用法、用量； 4) 使用、停用的日期。 b) 菌种生产（培养基制作、灭菌、冷却、接种、培养）及杂菌发生情况： 1) 培养基制作； 2) 高压灭菌； 3) 冷却； 4) 接种； 5) 培养。 c) 贮存过程及杂菌发生情况； d) 主要菌种生产设备及用具： 1) 主要菌种生产设备； 2) 主要菌种生产用具。 e) 生产场所名称、菌种数量、记录人、入档日期。
