1、 ICS 65.020.20 CCS B 05 山东省 地方标准 DB37/T 3690.3 2020 37 液体菌种制备技术规程 第 3 部分：平菇 Technical specifications for the preparation of liquid spawn Part 3:Pleurotus ostreatus 2020-12-04 发布 2021-01-01 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 3690.3 2020 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 基本要求 . 2 4.1 工作人员卫生要 求
2、. 2 4.2 场所要求 . 2 4.3 厂房要求 . 2 4.4 生产设施与设备要求 . 2 5 生产技术 . 3 5.1 工艺流程 . 3 5.2 母 种活化 . 3 5.3 摇瓶液体菌种生产 . 3 5.4 发酵罐液体菌种生产 . 4 5.5 贮藏 . 5 6 生产档案 . 6 附录 A（规范性） 平菇液体菌种生产记录事项 . 7 DB37/T 3690.3 2020 II 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件是 DB37/T 3690液体菌种制备技术规程的第 3部分。 DB37/T 3690已经发布了
3、以下部分： 第 1 部分：香菇 ； 第 2 部分：黑木耳 ； 第 3 部分：平菇； 第 4 部分：灵芝。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本文件由山东省农业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：山东省农业技术推广总站、泰安市农业科学研究院、山东省农业科学院农业资源 与环境研究所、济南市农业技术推广站、菏泽市定陶区特色农产品服务中心。 本文件主要起草人：赵淑芳、高瑞杰、高霞、王庆武、高中强、司元 明、张燕、崔慧、 桑 卫民、黄 春燕、韩建东、王晓婷、彭玮航、孙振福、张晓雱、马化彬。 DB37/T 3690.3
4、 2020 1 液体菌种制备技术规程 第 3 部分：平菇 1 范围 本文件规定了平菇（ Pleurotus ostreatus）液体菌种的术语和定义、基本要求、生产技术和生产 档案管理等要求。 本文件适用于平菇液体菌种的制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 150.1 压力容器 第 1部分 ： 通用要求 GB 4789.28 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T
5、12728 食用菌术语 GB 19172 平菇菌种 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 食用菌液体菌种发酵罐 edible mushroom liquid spawn fermenter 进行食用菌液体菌种培养的专用发酵设 备，是利用生物发酵原理，给菌丝生长提供最佳的营养、酸 碱度、温度、供氧量等生长条件，使菌丝快速生长，迅速扩繁，在短时间达到一定菌球数量的专用容器。 3.2 罐压 jar pressure 在液体菌种发酵制备过程中发酵罐内保持的空气压力（表压）。 注：
6、 单位为 MPa。 3.3 通气量 ventilation volume 在液体菌种培养过程中发酵罐体积与每分钟通入发酵罐中无菌空气体积的比例。 注： 用 V/V（发酵罐体积 /通入空气体积）表示。 3.4 接种量 inoculation amount 液体菌种体积与培养基体积的比例。 注： 用百分数表示。 DB37/T 3690.3 2020 2 3.5 液体菌种菌龄 period of liquid spawn running 液体菌种接入培养基开始计算的液体菌种培养时间。 3.6 发酵罐空消 empty fermenter sterilization 对尚未加水投料的空发酵罐进行高压灭菌
7、。 3.7 发酵罐实消 fermenter sterilization 对投料后的发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 3.8 空气过滤器 air filter 能对食用菌液体菌种发酵罐所用空气进行滤除杂菌和其他杂质，达到无菌洁净要求的设备。 3.9 摇瓶液体菌种 liquid spawn in shake flask 装至玻璃菌种瓶内在磁力搅拌器或恒温摇床上培养的液体菌种。 3.10 终止 pH initial pH value of medium 液体菌种达到放灌指标时的培养基 pH。 4 基本要求 4.1 工作人员卫生要求 工作人员应该保持个人卫生，进液体菌种发酵车间应穿戴经消毒处理的工作服、口罩、
8、鞋、帽等。 4.2 场所要求 生产场所应符合 NY/T 528的环境卫生要求，场地开阔、路面硬化。生产用水应符合 GB 5749要求。 4.3 厂房要求 4.3.1 厂房设计应符合 NY/T 528 环境卫生要求，增设摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室。 4.3.2 应设置与工作人员数量相适应的更衣室，车间入口处应设置洗手、消毒和干手设施。过道应设 置风淋室。 4.3.3 车间地面应能防水、防腐蚀、防渗漏、防滑，易清洗，有适当的排水坡度（ 1.0 1.5）和 良好的排水系统；墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水。 4.3.4 车间安装排气管道或者排风设备。 4.3.5 摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养
9、室应符合 GB 50073 要求。 4.3.6 车间设封闭式废物桶。 4.4 生产设施与设备要求 4.4.1 生产设施 培养基配制室、摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室规模要配套，布局合理，摇瓶菌种培养室、发 酵罐菌种培养室要有调温设施，其中培养基配制室空间洁净度应达到万级以上。菌种检验室和母种制作 室要有相应的实验检测设备和制种用的灭菌设施。 DB37/T 3690.3 2020 3 4.4.2 生产 设备与用具 应具有称量器、高压蒸汽灭菌锅、液体菌种发酵罐、液体菌种接种器、超净工作台、调温设备、除 湿设备、恒温培养箱、恒温 摇床或磁力搅拌器、冰箱、显微镜等及常规用具。压力容器应经政府有关部
10、门检验合格，符合 GB 150.1的 要 求。应具有 备用电源。 5 生产技术 5.1 工艺流程 工艺流程见图 1。 图 1 平菇液体菌种生产工艺流程 5.2 母种活化 母种活化配方及操作流程应符合 NY/T 528要求。活化后母种质量应符合 GB 19172要求。 5.3 摇瓶液体菌种生产 5.3.1 容器要求 使用无色或近无色专用玻璃菌种甁，可用棉塞（梳棉或化纤棉）、硅胶塞、专用封口透气膜封口。 5.3.2 培养基配方 宜选用以下配方，且培养基质应符合 NY/T 528要求： a) 配方 1：马铃薯（煮汁） 200 g/L、葡萄糖 20 g/L， pH 自然； b) 配方 2：葡萄糖 20
11、 g/L、蛋白胨 3 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、维生素 B1 5 mg/L， pH 自然； c) 配方 3：马铃薯（煮汁） 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L，维生 素 B1 10 mg/L， pH 自然。 5.3.3 培养基配制 按液体培养基配方配制，混合均匀，装入摇瓶中，装液量为摇甁容量的 50 % 60 %，瓶塞封口，并 用报纸或牛皮纸包扎。 5.3.4 灭菌 DB37/T 3690.3 2020 4 将分装好的摇瓶放入灭菌锅内，锅内留有一定的空隙。检查锅内水位，立即灭菌。灭菌蒸汽压力升 至 0.11 MPa
12、 0.13 MPa，恒压维持 20 min 30 min。 5.3.5 接种 待培养基冷却至室温，在无菌条件下，用接种针挑取 5 6块（ 3 5） mm（ 3 5） mm的母种块迅速 转接于摇甁培养基内，封口。 5.3.6 摇瓶液体菌种培养 23 25 条件下，静置培养 24 h，然后置于摇床上震荡培养，转速 140 r/min 160 r/min，培养 时间 4 d 6 d。 5.3.7 摇瓶液体菌种质量要求 菌液澄清透明，菌丝体分布均匀，无异味，有平菇特有的香气；镜检无杂菌、菌丝形态正常。 5.4 发酵罐液体菌种生产 5.4.1 发酵罐空消 发酵罐初次使用、出现杂菌、长期放置、更换品种等情
13、况出现其一时，应空消。蒸气压力 0.14 MPa、 温度 126 ，维持 40 min。 5.4.2 发酵罐液体菌种培养基配方 宜选用以下配方，且培养基质应符合 NY/T 528要求： a) 配方 1：马铃薯（煮汁） 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、消泡剂 0.3 g/L， pH 自然； b) 配方 2： 葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 3 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、维生素 B1 5 mg/L、 消泡剂 0.3 g/L， pH 自然； c) 配方 3：马铃薯（煮汁） 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、硫酸镁 0.5 g/L、维生 素
14、 B1 10 mg/L、消泡剂 0.3 g/L， pH 自然。 5.4.3 上罐、定容 用水把原料搅拌均匀，加入罐内，装液量为罐体容量的 70 % 80 %，通入空气搅拌 1 min 2 min，混 合均匀，拧紧上料口盖。 5.4.4 发酵罐实消 发酵罐夹套通入冷水，水位低于排水口 20 cm，关闭进水阀、排水阀后加热。待夹套蒸汽压力达到 0.05 MPa时，缓慢打开排气阀降压至 0 MPa，关闭排气阀，再次升压至 0.1 MPa 0.14 MPa；待发酵罐罐内 蒸汽压力达到 0.05 MPa时，缓慢打开排气阀降压至 0 MPa，关闭排气阀，再次升压至 0.11 MPa 0.12 MPa， 同
15、时打开空气过滤器灭菌，微开排气阀，维持 50 min 60 min。 5.4.5 冷却 灭菌结束，关闭空气过滤器灭菌阀与排气阀，缓慢打开夹套排气阀降压至 0 MPa，通入冷水降温； 同时缓慢打开发酵罐罐内排气阀降压，待压力接近 0.02 MPa 0.04 MPa时向罐内通入无菌空气，调整排 气阀，维持罐压 0.04 MPa 0.05 MPa，培养液温度降至 25 以下时，关闭夹套进水阀。 5.4.6 接种 DB37/T 3690.3 2020 5 将摇瓶接种管和发酵罐接种口用 75 %酒精消毒，用 95 %酒精的火焰圈套在接种口上，轻微打开呼吸 器阀门，使发酵罐罐内压力为 0.01 MPa。点
16、燃火焰圈，在火焰保护下用镊子去掉接种管上的牛皮纸和瓶 塞，打开接种口阀门，将接种管插入接种口，将摇瓶菌种注入发酵罐。接种量为 0.5 % 1.0 %。拔出接 种管，关闭接种阀门，去掉火焰圈，继续通入无菌空气。 5.4.7 发酵培养 根据菌 丝生长情况，适时调节进气阀门，通入适量无菌空气，通气量一般为 1： 0.8 1： 1，同时调 节排气阀，维持罐压 0.02 MPa 0.05 MPa，培养温度控制在 23 25 ，培养 5 d 7 d。 5.4.8 发酵罐液体菌种质量标准 5.4.8.1 感官要求 感官指标应符合表 1的规定。 表 1 平菇发酵罐液体菌种感官要求 项目 要求 菌液色泽 菌丝体
17、呈白色，菌液呈淡黄色 菌液形态 菌液粘稠不分层，菌丝体分布均匀 菌液气味 有平菇液体培养时特有的香气，无异味，发酵罐排气口气味正常 显微镜下菌丝形态 菌丝粗壮，有隔膜，可见锁状联合 5.4.8.2 理化指标 理化指标应符合表 2的规定。 表 2 平菇发酵罐液体菌种理化指标 项目 要求 终止 pH 5.5 6.5 菌丝湿重（ mg/mL） 50 5.4.9 液体菌种检测 5.4.9.1 形态学观察。主要是通过肉眼观察菌球形态，通过 显微镜观察菌丝体形态。 5.4.9.2 霉菌检验。按照无菌操作从取样阀取少量培养液，接种于 GB 4789.28中规定的 PDA培养基中， 置于 28 30 恒温培养
18、 48 h，采用显微镜和感官观察菌丝生长状况和有无霉菌污染，必要时进行水 封片镜检。 5.4.9.3 细菌检验。按照无菌操作从取样阀取少量培养液，接种于 GB 4789.28 中规定的营养肉汤培养 液中，置于 28 30 恒温培养 24 h 48 h，观察是否有细菌污染 ,必要时进行镜检和划线培养检验。 5.4.9.4 pH 测定。取样用 pH 计或 pH 试纸测定菌液酸碱度。 5.4.9.5 菌丝湿重测定。称取一定体积的培养液，经 10 000 r/min 离心 5 min，称重。 5.5 贮藏 DB37/T 3690.3 2020 6 平菇液体菌种生产后应立即使用，如不能立即使用，需进行贮
19、藏。贮藏环境温度低于 20 。发酵 罐内液体菌种，持续通无菌空气，保持罐压 0.02 MPa 0.03 MPa，可存放 2 d。 6 生产档案 母种、摇瓶液体菌种和发酵罐液体菌种生产的 每个环节都要有详实的记录，记 录内容应按 附录 A执 行。生产记录归档保存，至少 2年。 DB37/T 3690.3 2020 7 附录 A （规范性） 平菇液体菌种生产记录事项 平菇液体菌种生产记录事项如下： a) 生产投入品使用情况（包括液体菌种的制作培养基质、营养辅料、所用菌种、菌瓶）： 1) 名称； 2) 来源； 3) 用法、用量； 4) 使用、停用的日期。 b) 菌种生产（培养基制作、灭菌、接种、培养）及杂菌发生情况： 1) 培养基制作； 2) 高压灭菌； 3) 接种； 4) 培养。 c) 贮藏过程及杂菌发生情况； d) 主要菌种生产设备及用具： 1) 主要菌种生产设备； 2) 主要菌种生产用具。 e) 生产场所名称、菌种数量、记录人、入档日期。
