1、 ICS 65.020.01 B 05 DB36 江 西 省 地 方 标 准 DB36/T 13662020 柑橘黄龙病检测鉴定技术规程 Technical regulation for detection of Candidatus liberibacter asiaticus using the PCR 2020 - 12 - 29发布 2021 - 07 - 01实施 江西省市场监督管理局 发布 DB36/T 13662020 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业农
2、村厅提出并归口。 本文件起草单位：国家脐橙工程技术研究中心。 本文件主要起草人：易龙、黄爱军、苏华楠、赖晓桦、卢占军、钟八莲。 DB36/T 13662020 1 柑橘黄龙病检测鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了实验室检测鉴定柑橘黄龙病的PCR技术要求，针对CaLas的PCR检测方法。 本文件适用于柑橘类植物感染柑橘黄龙病植株的PCR检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文 件。 GB/T 28062 柑桔黄龙病菌实时
3、荧光PCR检测方法 GB/T 29393 柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定 3 术语和定义 GB/T 28062界定的术语和定义以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 柑橘黄龙病 Citrus Huanglongbing，HLB 由革兰氏阴性细菌引起的一种系统性侵染病害，在田间主要通过柑橘木虱、病穗嫁接传播，植株感 病后典型症状为叶片斑驳状黄化，果实着色与正常果实相反，又称“红鼻果”，果小质劣，是一种重要 的检疫性病害。 3.2 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction，PCR 一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。 4 柑橘黄龙病菌基本信息 柑橘黄龙病菌是
4、一种革兰氏阴性细菌，其暂定分类地位为：变形菌门（Proteobacteria），-变形 菌纲（Alphaproteobacterial），根瘤菌目（Rhizobiales），根瘤菌科（Rhizobiaceae），韧皮部杆 菌属（Liberibacter）。该属三种细菌是柑橘黄龙病的病原菌，分别为韧皮部杆菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus（CaLas），韧皮部杆菌非洲种Candidatus Liberibacter africanus和韧 皮部杆菌美洲种Candidatus Liberibacter americanus，目前这三个种均不能人工纯培养，我国
5、发病 区及江西省内发病区的病原菌主要为其中的CaLas。 DB36/T 13662020 2 5 方法原理 柑橘黄龙病的病原菌属难培养菌，目前尚无方法进行人工培养，因此无法通过传统微生物培养的方 法来鉴定病害。根据CaLas的16S 核糖体（16S rDNA）基因序列设计一对特异性引物，以疑似植株样品 的总核酸为模板，进行PCR扩增，最终通过电泳技术检测有无特异性DNA条带，来判断检测样品是否感染 CaLas。 6 田间症状识别 柑橘黄龙病的田间症状具有一定复杂性，可出现叶片斑驳状黄化，缺素状黄化，均匀黄化，果实着 色异常，树势减弱等。较为可靠的田间诊断症状为：叶片上出现的斑驳状黄化和挂果期出
6、现的“红鼻果” 症状，见附录A。叶片斑驳状黄化和“红鼻果”症状可以作为黄龙病田间诊断的判断标准，要最终确诊， 需要对疑似样品进行PCR检测。 7 检测方法 7.1 样品的采集与保存 7.1.1 叶片样品 7.1.1.1 疑似症状植株取样，优先挑取有症状叶片。无症状植株，即按照树冠东、南、西、北四个方向 采集，每个方向取树冠中下部成熟叶片五片，共采集叶片20张。 7.1.1.2 苗圃取样时优先挑取表现疑似症状植株。没有发现疑似症状时，可按照抽检方规定抽检率随机 抽取一定数目植株，每株取中下部成熟叶片10片。 7.1.2 果实样品 幼果期采样时，每个植株按照东、南、西、北四个方向采集幼果，切取果柄
7、、果蒂。商品鲜果取样 时每批次果实随机抽取10个果实，取果实中柱。 7.1.3 样品的保存 采集的样品用样品袋进行分装，并做好每个样品的记录，样品记录和样品必须同时送实验室。实验 室对于接收样品进行登记编号，存放于4条件下，及时进行样品DNA核酸抽提。 7.2 主要的设备仪器和试剂 7.2.1 设备仪器 普通PCR仪，实验中需要用到的其他仪器设备参照GB/T 28062和GB/T 29393。 7.2.2 主要试剂 除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯。 十六烷基三甲基溴化胺（CTAB） 十二烷基硫酸钠（SDS） 四甲基乙二胺二钠盐（EDTA-Na2） 三羟甲基氨基甲烷（Tris Base）
8、 DB36/T 13662020 3 聚乙烯吡咯烷酮（PVP） Triton X-100 蛋白酶 K Taq DNA 聚合酶 7.3 样品的预处理 7.3.1 叶片样品，使用一次性刀片，切取叶片的叶柄及主脉部分，取样叶片数目不低于5片，取样重 量控制在0.29g0.31g。 7.3.2 果实取样，将果实剖开，使用一次性刀片，切取果实的中柱部分，取样果实数目不低于5个， 取样重量控制在0.29g0.31g。 7.4 样品DNA的提取 按照以下步骤进行： 1) 取1.5 mL离心管加入抽提液900 L，蛋白酶K 10L，放入水浴锅中，5565备 用； 2) 将称取好的叶片或果实样品，放入研钵中加入
9、液氮充分研磨，直至成细粉，迅速转入水 浴离心管中并用力摇匀，水浴30min40 min，中间每隔10min 将离心管取出颠倒混匀， 混匀后继续水浴； 3) 水浴结束后，将离心管13000rpm离心1min，吸取上清液转入新的1.5mL离心管，加入等 体积的Tris-酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），轻柔颠倒混匀呈乳浊状，室温下静置至少 10 min； 4) 13000 rpm离3min，吸取上清液转入1.5 mL离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）， 轻柔颠倒混匀，静置至分层； 5) 13000 rpm离心2min，吸取上清液转入1.5mL离心管，加1/10体积的醋酸钠溶液，再加 入
10、等体积的异丙醇溶液，轻柔颠倒混匀，出现白色絮状沉淀，室温静置10min； 6) 2000 rpm 离心20s，倒去上清，加入75%乙醇溶液漂洗23次； 7) 最后一次漂洗时，12000 rpm离心1 min，收集沉淀，放置金属浴上55干燥沉淀至半透 明状； 8) 加入120L200L TE 溶液，手指轻弹溶解沉淀，若沉淀不易溶解时，可使用金属 浴55助溶，短暂离心10s收集溶液，放入20贮存备用。 7.5 PCR扩增 7.5.1 PCR扩增体系见表1，扩增体系总体积为25L。 表1 柑橘黄龙病菌PCR扩增体系 试剂（Reagent） 每管用量（(Volume，L） 10PCR Buffer 4
11、.5 10 mol/L上游引物 0.4 10 mol/L下游引物 0.4 10 mmol/L dNTPs 0.3 5 U/L rTaq DNA聚合酶 0.3 ddH2O 18.1 模板 1.0 合计 25 DB36/T 13662020 4 7.5.2 PCR扩增的上游引物/下游引物为引物为：OI1/OI2c，引物序列为：OI1： GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA；OI2c：GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT。 7.5.3 PCR反应程序：94，预变性，3 min；94，变性，30 s，64，退火，30 s，72，延伸， 80 s，35 个循环；72，延伸 7 min。
12、扩增实验过程必须设置阴性对照和阳性对照。阴性对照为健康 柑橘样品总核酸，阳性对照为确定感染柑橘黄龙病样品总核酸。阴性对照和阳性对照必须与有柑橘黄龙 病检测资质实验室进行比对实验确认后，方可采用。 7.6 琼脂糖凝胶电泳 PCR产物电泳程序：取5L7L PCR产物，加2L 6loading buffer，充分混合后，上样于1.2% 琼脂糖胶胶孔中，100 V，电泳30 min，经溴化乙锭（EB）溶液（0.5g/mL）染色20 min30 min，使 用凝胶成像系统观察结果。 8 结果判定 电泳结束后于凝胶成像系统观察，阳性对照泳道应出现一条约1160 bp的特异性条带，阴性对照泳 道没有任何扩增
13、条带。若待检样品泳道出现与阳性对照相同大小的1160 bp特异性条带，则判定该样品 为阳性，即携带柑橘黄龙病病原菌，若待检样品泳道未出现任何扩增条带，则判定样品为阴性，即未携 带柑橘黄龙病病菌。 DB36/T 13662020 5 A A 附 录 A （资料性） 柑橘黄龙病症状 A.1 柑橘黄龙病症状 A.1.1 柑橘黄龙病叶片症状 叶片斑驳状黄化：从叶片基部、中脉两侧叶肉或叶片边缘开始出现黄化，形状不规则，边界模糊， 与正常绿色组织相互融合在一起，形成斑驳状的褪绿黄化，见图A.1。 图A.1 柑橘黄龙病叶片症状 A.1.2 柑橘黄龙病果实症状 “红鼻果”症状：主要表现为沿果实中柱向一侧歪斜，
14、果小，且很容易落果。果实成熟时不转色或不 完全转色。病果和正常果实着色顺序完全颠倒，病果果蒂和果肩周围先着色，其余果皮可能至采收期后 仍会一直保持绿色，该类病果称之为“红鼻果”，见图A.2。 图A.2 柑橘黄龙病“红鼻果”果实症状 DB36/T 13662020 6 参 考 文 献 1 苏华楠，王雪峰，黄爱军，李中安，唐科志，周常勇.高质量提取柑橘样品中病原总核酸方法的建立 J，园艺学报，2014,41（11）：2342-2352. 2 Sandrine Jagoueix, Joseph-Marie Bove, Monique Garnier. The phloem-Limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the subdivision of the ProteobacteriaJ. International Journal of Systematic Bacteriology, 1994, 44(3): 379-386. _
