1、ICS 65.020.01 B 15 DB35 福建省地方标准 DB35/T 19282020 茄子抗枯萎病鉴定技术规范 Technical specification for evaluation of eggplant (Solanum melongena L.) resistance against fusarium wilt 2020 - 09 - 29 发布 2020 - 12 - 29 实施 福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 19282020 I 目 次 前言 . .II 1 范围 . .1 2 术语和定义 . .1 3 培养基的配制 . .2 4 接种体制备 . .2 5
2、 室内抗性鉴定 . .3 6 病情调查 . .3 7 抗病性评价 . .4 8 鉴定材料处理 . .5 附录 A（资料性附录） 科赫（k och）法则. .6 DB35/T 19282020 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院作物研究所、福建省标准化研究院、福建省标院信息技术有限 公司、福州市蔬菜科学研究所。 本标准主要起草人：林珲、温庆放、王彬彬、薛珠政、李大忠、李永平、马慧斐、裘波音、陈继兵、 黄建都。 DB35/T 19282020 1 茄子抗枯萎病鉴定技术规范
3、 1 范围 本标准规定了茄子（ Solanum melongena L.）抗枯萎病鉴定培养基的配制、接种体制备、室内抗性 鉴定、病情调查、抗病性评价及鉴定材料处理。 本标准适用于茄子枯萎病室内抗病性鉴定和抗性评价。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 茄子枯萎病 eggplant fus arium wilt 由尖孢镰刀菌茄子专化型（ Fusarium oxysporum f. sp. melongenae Matuo et Ishigami Schlecht.） 引起的土传性病害。 2.2 接种体 inoculum 用于接种以引起茄子植株枯萎病的病菌分生孢子悬浮液。 2.3
4、 室内抗病性鉴定 evaluation of disease resistance in greenhouse 在室内模拟自然环境，采用伤根浸根法接种，将茄子枯萎病菌按一定浓度接种于茄子植株上，通过 调查茄子的发病情况，对参鉴茄子品种进行抗性评价的抗病性鉴定方法。 2.4 伤根浸根法 root dip method with wounded root 将茄子苗的根部用剪刀制造伤口，将苗浸入茄子枯萎病菌悬浮液中，移栽入经灭菌处理的无病菌洁 净土壤或基质中，使其感染枯萎病菌的接种方法。 2.5 病情级别 disease ra ting scale 人为定量茄子个体或群体发病程度的数值化描述。 2.
5、6 病情指数 disease index；DI 通过对茄子个体发病程度（病情级别）数值的计算所获得的群体发病程度的数值化描述。 2.7 抗性评价 evluatio n of resistance level 根据采用的技术标准判别茄子对特定病害反应程度和抗性水平的描述。 DB35/T 19282020 2 3 培养基的配制 3.1 马铃薯固体培养基 马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g。将马铃薯去皮、切成小块，水煮沸30 min，纱布过滤。加 入葡萄糖和琼脂粉，将滤液定容至1 000 mL，121 高压灭菌 20 min。 3.2 马铃薯液体培养基 除不使用琼脂外，配方与制备方法均按
6、3.1的规定执行。 4 接种体制备 4.1 枯萎病菌的分离与保存 4.1.1 枯萎病菌的分离 对收集的茄子枯萎病病株，应采取新鲜病株的 发病组织与健康组织交界处用75%乙醇消毒30 s，无 菌水冲洗34次，再用1%的次氯酸钠溶液（有效氯9.5 g/L10.5 g/L）浸泡5 min，无菌水冲洗34 次，用无菌切割刀切取0.3 cm1.0 cm的木质部薄片， 置于含有100 g/mL链霉素的培养基平板上，在 26 恒温箱中培养。 4.1.2 枯萎病菌的纯化 在培养基接种处切取一块0.4 cm0.8 cm的菌饼，放置于1.5 mL离心管中，加800 L无菌水，剧 烈振荡1 min，制备成孢子悬浮液
7、；吸取孢子悬浮液15 L，用血球计数器计数，并配制成浓度为 100 个/mL1 000 个/mL的孢子悬浮液；吸取150 L孢子悬浮液均匀涂布于培养基上，26 下培养60 h后，挑选枯萎病病菌单孢菌落于新的培养基上，用于保存和研究。 4.1.3 枯萎病菌的鉴定 分离物进行纯化后，应经形态学鉴定、分子生物学鉴定和致病性测定三个步骤确认为尖孢镰刀菌。 经科赫（Koch）法则（参见附录A）验证。进一步通过寄主鉴定确定为尖孢镰刀菌茄子专化型。 4.1.4 枯萎病菌的保存 将纯化后的枯萎病菌培养产孢，用灭菌蒸馏水洗下分生孢 子，离心收集，将孢子溶解于20%的甘油 -80 冷冻保存。 4.2 接种体繁殖
8、应采用划线培养的方法将保存在超低温冰箱中的枯萎病菌 接种于培养基上，置于26 恒温培养箱 中培养7 d，挑取典型特征的枯萎病菌单菌落，接种于盛有150 mL液体培养基的300 mL锥形瓶中，在26 下以150 r/min振荡培养7 d ，鉴定枯萎病菌的致病性（感病材料在常规接菌量下病情指数大于80.00可 用），培养液经四层纱布过滤，血球计数板确定浓度，用灭菌蒸馏水将滤液稀释成所需接种浓度。 DB35/T 19282020 3 5 室内抗性鉴定 5.1 鉴定室 人工接种鉴定室内，温度白天20 25 ，夜晚18 2 ，光照强度300 mo lm-2s-1，光 照时长12 h，以满足人工接种后茄子
9、所需的发病环境。 5.2 鉴定对照材料 感病对照材料为茄子06-1（福建省农科院作物所培育），抗病对照品种为福茄8号。 5.3 鉴定材料育苗 鉴定种子应在1%次氯酸钠溶液中浸种10 min， 清水冲洗后置于25 的恒温培养箱中催芽，将萌发 种子播种于育苗穴盘内。每份鉴定材料20株苗，重复3次。 5.4 接种 5.4.1 接种时期 茄子处于23片真叶期。 5.4.2 接种浓度 接种悬浮液的孢子浓度应为110 6 cfu/mL。 5.4.3 接种方法 应采用伤根浸根法接种。将幼苗连根轻轻拔起，剪掉所有根系的一小截达到伤根目的。接着把根全 部浸于接种悬浮液内30 min，将接种后的茄子苗定植于装有消
10、毒过的育苗基质的育苗盆中，每盆1株。 5.5 接种后管理 接种后应将植株置于鉴定室内，每天光照14 h，强度为300 mol m-2s-1，保持植株正常生长的 土壤湿度（土壤含水量80%左右），接种期间鉴定室温度应控制在28 30 范围内。 6 病情调查 6.1 调查时间 接种28 d后，调查病情。 6.2 调查标准 调查标准如下： 0 级：植株无症状； 1 级：1 片叶片轻微变黄； 2 级：2 片叶片中度变黄； 3 级：全部叶片均中度变黄或部分萎焉； 4 级：仅生长点存活； 5 级：植株死亡。 DB35/T 19282020 4 6.3 病情调查、记载 应根据发病情况，按照调查标准记载病情。
11、 7 抗病性评价 7.1 病情指数计算公式 应根据病情调查结果计算每份鉴定材料的病情指数。病情指数按公式（1）计算： 100 )( NS ns D . (1) 式中： D 病情指数（DI）； s 各病级代表的数值； n 各级病株数，单位为株； S 最高病情级别的代表数值； N 调查总植株数，单位为株。 3次重复结果平均值为每份鉴定材料的病情指数。 7.2 抗性评价 按照表1的规定对各鉴定材料的抗病性进行评价。 表1 茄子对枯萎病抗性评价表 病情指数（ D）范围 抗性级别 D0 免疫（I） 0 D10 高抗（HR） 10 D30 抗病（R） 30 D50 中抗（MR） 50 D70 感病（S）
12、D70 高感（HS） 7.3 鉴定记载表格 茄子抗枯萎病鉴定结果记载表格见表2。 DB35/T 19282020 5 表2 茄子鉴定材料抗枯萎病鉴定结果记载 病情级别 编号 鉴定材料名称 来源 重复区号 0 1 2 3 4 5 病情指数 平均 病指 抗性 评价 1.播种日期： 2.接种日期： 3.接种生育期： 4.接种病原菌分离物编号： 5.记载人： 6.调查日期： 7.4 鉴定有效性判别 当感病对照达到其相应感病程度（ D50）时，则该批次抗枯萎病鉴定判定为有效。 8 鉴定材料处理 鉴定完毕后应将茄子发病植株、残体集中焚烧或深埋处理，基质高温灭菌。 DB35/T 19282020 6 A A
13、 附 录 A （资料性附录） 科赫（koch）法则 A.1 定义 科赫法则（Koch postulates ）又称证病律，通常是用来确定侵染性病害 病原物的操作程序。科赫 法则是伟大的德国细菌学家罗伯特科赫（Robert Ko ch，18431910年）提出的一套科学验证方法， 用以验证微生物与病害的关系，被后人奉为传染病病原鉴定的金科玉律。它为病原微生物学系统研究方 法的建立奠定了基础，使其成为一门独立的学科。 A.2 内容 科赫法则（Koch postulates）包括： 在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者体内不存在； 从宿主分离出这样的微生物并在培养基中得到纯培养(pure culture)； 用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的宿主，同样的疾病会重复发生； 从试验发病的宿主中能再度分离培养出这种微生物来。 如果进行了上述4个步骤，并得到确实的证明，就可以确认该生物即为该病害的病原物。 A.3 运用 随机挑选茄子上分离到的尖孢镰刀菌菌株5株及从茄子上分离的镰刀菌属的其他菌株，扩大培养后 分别配成浓度为1.010 6 cfu/mL孢子悬浮液，采用浸根法接种相对应的寄主健康植株，植株大小为地 上部株高约为15 cm的健康植株，浸根时间为30 min，以清水作对照，各菌株处理30株，观察发病情况， 重新分离发病株的病原物。 _
