1、 ICS 65.120 B 46 DB35 福建省地方标准 DB35/T 19382020 饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光 PCR 检测方法 Duplex real-time PCR assay for Salmonella and Serratia in feeds 2020 - 09 - 29 发布 2020 - 12 - 29 实施 福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 19382020 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 缩略语 . . 1 4 检测原理 . . 1 5 主要仪器 . . 2 6 培养基和试剂 . . 2 7
2、样品的采 集和制备 . . 2 8 操作步骤 . . 2 9 检测过程 中防止交叉污染的措施 . 4 附录 A（规范 性附录） 培养液的配制 . 5 DB35/T 19382020 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国福州海关提出并归口。 本标准起草单位：福州海关技术中心、海口海关技术中心、福建农林大学动物科学学院、厦门瑞德 利校准检测技术有限公司。 本标准主要起草人：王武军、张体银、吴山楠、阮靖华、郑腾、俞道进、郑晶、白泉阳、王莹莹、 张志灯、于师宇、林杰。 DB35/T 19382020 1 饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光 PCR 检测
3、方法 1 范围 本标准规定了饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光PCR检 测方法有关的检测原理、主要仪器、培养 基和试剂、样品的采集和制备、操作步骤、检验过程中防止交叉感染的措施。 本标准适用于饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的测定 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Real-t
4、ime PCR：荧光PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction） DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyrib onucleic Acid） Ct值： 每个反应管内的荧光信号量达到设定的荧光阈值时所经历的循环数 （Cycle Threshold Value） 4 检测原理 4.1 用非选择性液体培养基预增菌 将饲料样品接种到缓冲蛋白胨水，在36 1 条件下培养16 h20 h。 4.2 在选择性培养基上增菌 将4.1中的培养物接种到亚硒酸盐胱氨酸培养基和氯化镁- 孔雀绿培养基中，分别于36 1 、 42 1 条件下培养24 h。 4.3 提取 DNA 进行实时荧光
5、 PCR 检测和判断 提取4.2中培养物的DNA。采用TaqMan方法，分别设计针对沙门菌属和居泉沙雷菌的特异性引物和特 异性的荧光探针进行配对。当样品中含有沙门菌或居泉沙雷菌时，前增菌后提取的细菌DNA通过PCR成指 数扩增，在反应过程中沙门菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交，同时被 Taq酶水解，把探针上的荧光基团 和淬灭基团分开，游离的荧光基团信号被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号 的增长呈对应关系。从而通过荧光增量来实时判断沙门菌和居泉沙雷菌的存在与否。 DB35/T 19382020 2 5 主要仪器 5.1 恒温培养箱：36 1 ，42 1 。 5.2 振荡器
6、。 5.3 电子天平：感量 0.1 g。 5.4 无菌锥形瓶：容量 500 mL、250 mL。 5.5 单道可调移液器：容量 0.2 L1 mL。 5.6 生物安全柜。 5.7 荧光 PCR 仪。 5.8 冷冻离心机。 5.9 高压灭菌器。 6 培养基和试剂 6.1 水：应符合 GB/T 6682 中三级水的要求。 6.2 缓冲蛋白胨水（BPW）：配制方法按照附录 A 中的 A.1。 6.3 氯化镁-孔雀绿（RV）增菌液：配制方法按照附录 A 中的 A.2。 6.4 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：配制方法按照附录 A 中的 A.3。 6.5 商品化的实时荧光 PCR 预混液。 6.6 商品化
7、的细菌基因组 DNA 提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。 6.7 沙门菌荧光 PCR 检测用引物（对）和探针序列为： invA-F：5-ATGGAAGCGCTCGCATTGTG-3 invA-R：5-GGCTGAGGAAGGTACTGCCA-3 invA-P：5-JOE-TGCTCGTAATCCGCCGCCATTGGCG-BHQ1-3 扩增片段为199 bp，用ddH 2O溶解至10 mol/L后，保存于-20 备用。 6.8 居泉沙雷菌荧光 PCR 检测用引物和探针序列为： gyrB-F：5-TCGGTGAAACCGATCAGAC-3 gyrB-R：5-GCCAGGATGTCGTACT
8、CAAA-3 gyrB-P：5-FAM-CTGCGCTTCTGGCCGAGCTT-BHQ1-3 扩增片段为94 bp，用ddH 2O溶解至10 mol/L后，保存于-20 备用。 7 样品的采集和制备 样品的采集和制备按照GB/T 13091的规定进行。 8 操作步骤 8.1 前增菌 无菌条件下称取25 g样品，加入装有225 mL灭菌BPW（6.2）的500 mL无菌锥形瓶内，置于振荡器中， 以8 000 r/min10 000 r /min振荡2 min3 min，于36 1 条件下培养18 h2 h。 DB35/T 19382020 3 8.2 选择性增菌 取8.1中的前增菌培养物1 m
9、L，接种于装有10 mL RV（6.3）的试管中，于42 1 培养24 h。 另取8.1中的前增菌培养物1 mL，接种于装有10 mL SC（6.4）的试管中，于36 1 条件下培养24 h。 8.3 提取 DNA 进行实时荧光 PCR 检测 8.3.1 样品 DNA 提取 8.3.1.1 应在样本处理区进行。取 n 个1.5 mL 灭菌离心管，其中 n 为待检样品数和阴性、阳性对照数 的总和，对每个管进行编号标记。 8.3.1.2 取 8.2 中的选择性增菌培养物各 1 mL 分别加入 2 个 1.5 mL 灭菌离心管中，10 000 r/min 离 心 5 min，弃上清，加入 50 L
10、DNA 提取液，充分混匀后沸水浴 5 min，13 000 r/min 离心 5 min，取 上清液进行检测或保存于-20 待检。 8.3.2 扩增试剂的准备和配制 将PCR反应液平衡至室温，在反应混合物配制区按表1的规定进行配制和分装，每个样品建立20 L 反应体系。 表1 二重 Real-time PCR 反应体系 试剂 使用量/反应体系 Premix Ex TaqTM（2 ） invA-F（10 mol/L） invA-R（10 mol/L） invA-P（10 mol/L） gyrB-F（10 mol/L） gyrB-R（10 mol/L） gyrB-P（10 mol/L） 无 RNA
11、 酶的 ddH 2O DNA 模板 总体积 10 L 0.4 L 0.4 L 0.4 L 0.4 L 0.4 L 0.4 L 5.6 L 2 L 20 L 8.3.3 加样 应在加样区进行。在每个PCR反应管中分别加入8.3.1中提取的样品DNA或阴性对照、阳性 对照各2 L， 盖紧管盖，500 r/min离心30 s。 8.3.4 二重荧光定量 PCR 方法的反应条件 应在检测区进行。将8.3.3中加样后的PCR 管放入荧光PCR仪内，记录相应样品摆放顺序。设定采集 JOE、FAM荧光信号。反应参数：95 ：30 s，1个循环；95 ：5 s，64 ：30 s（信号采集），40 个循环。反应
12、体系设为20 L。 DB35/T 19382020 4 8.3.5 结果判定 8.3.5.1 结果分析条件设定 结果分析时基线确定：取3l5个循环的荧光值，设定阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。 8.3.5.2 质控标准 阴性对照无Ct值显示或Ct值为40，阳性对照Ct值30.0，并且出现典型的S型扩增曲线，否则视为 无效实验。 8.3.5.3 结果描述及判定 检测样品Ct值35.0且有典型S型扩增曲线时，报告沙门菌或居泉沙雷菌核酸阳性/25 g。 检测样品Ct值为零或Ct值35.0时，报告沙门菌或居泉沙雷菌核酸未检出/25 g。 对于沙门菌阳性的样品，需要时，可按照GB/T 13091
13、的规定进一步开展生化试验和血清学分型试验 进行确证。 9 检测过程中防止交叉污染的措施 防止核酸检测过程中PCR污染的预防和处理措施参见GB/T 274032008附录D。由于沙门菌为人兽共 患病原，实验操作过程应符合GB 19489的相关要求。 DB35/T 19382020 5 A A 附 录 A （规范性附录） 培养液的配制 A.1 缓冲蛋白胨水（BPW） A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠(Na 2HPO412H 2O) 9.0 g 磷酸二氢钾(KH 2PO4) 1.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.1.2 制备 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，
14、静置约10 min，煮沸溶解，调节pH至7.20.2，分装于大瓶中， 121 高压灭菌20 min，临用时分装于500 mL瓶中，每瓶225 mL，或配好后校正pH，分装于500 mL瓶中， 每瓶225 mL，121 高压灭菌20 min，备用。 A.2 氯化镁-孔雀绿（RV）增菌液 A.2.1 溶液A A.2.1.1 成分 蛋白胨 5.0 g 氯化钠 8.0 g 磷酸二氢钾(KH 2PO4) 1.6 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.1.2 制备 将各成分加入蒸馏水中，加热至约70 溶解，调节pH至7.0，此溶液应在配制当日使用。 A.2.2 溶液B A.2.2.1 成分 氯化镁（MgC
15、 l26H 2O) 400.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2.2 制备 将氯化镁溶于蒸馏水中。 DB35/T 19382020 6 A.2.3 溶液C A.2.3.1 成分 孔雀绿 0.4 g 蒸馏水 100 mL A.2.3.2 制备 将孔雀绿溶于蒸馏水中，室温保存于棕色玻璃瓶中。 A.2.4 完全培养基 A.2.4.1 成分 溶液A 1 000 mL 溶液B 10 0 mL 溶液C 10 .0 mL A.2.4.2 制备 按上述比例配制，调节pH，使灭菌后pH至5.2，分装于试管中，每管10 mL。115 高压灭菌15 min， 4 保存。 A.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
16、 A.3.1 基础液 A.3.1.1 成分 胰蛋白胨 5.0 g 乳糖 4. 0 g 磷酸氢二钠(Na 2HPO412H 2O) 10.0 g 亚硒酸氢钠 4.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.3.1.2 制备 将胰蛋白胨、乳糖和磷酸氢二钠溶于蒸馏水中，煮沸5 min，冷却后，以无菌操作加入亚硒酸氢钠。 A.3.2 L-胱氨酸溶液 A.3.2.1 成分 L-胱氨酸 0.1 g 1 mol/L氢氧化钠溶液 15.0 mL A.3.2.2 制备 在灭菌条件下，用灭菌蒸馏水将上述成分稀释到100 mL，无须蒸汽灭菌。 DB35/T 19382020 7 A.3.3 完全培养基制备 基础液 100 mL L-胱氨酸溶液 10.0 mL 基础液冷却后，以无菌操作加入L-胱氨酸溶液，调节pH至7.00.2，摇匀后，将培养基分装至适当 容量的无菌试管中，每管10 mL。此培养基应在配制当日使用。 _
