1、ICS 65.020.20 B 21 DB32 江苏省 地方标准 DB 32/T 3860 2020 玉米 品种及 纯度 鉴定 技术规程 SNP 标记法 Technical regulation for identification of maize varieties and purity SNP marker method 2020 - 10 - 13 发布 2020 - 11 - 13 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3860 2020 I 前 言 本 标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草 。 本标准由 江苏省 农业科学院 提出 并归口 。 本标准起草单位：
2、江苏省农业科学院。 本标准主要起草人： 赵涵 、 张体付 、 吕远大、陈艳萍、林峰、陆海燕、梁帅强 。 DB32/T 3860 2020 1 玉米 品种及 纯度 鉴定 技术规程 SNP 标记法 1 范围 本标准规定了 利用 SNP（ single nucleotide polymorphism）标记进行 玉米 品种 及 纯度 鉴定 的 原理、仪 器设备 及 试剂、 引物信息、操作 步骤 等要求 。 本标准适用于 玉米 自交系 、 单交种 及 纯度的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日 期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最
3、新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 SNP 标记 single nucleotide polymorphism marker 基于单核苷酸多态性的分子标记。 3.2 推荐引物 recommended primer 品种鉴定中优先选用的一套 SNP 引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。 3.3 竞争性等位 基因特异性 PCR（ KASP, Kompetitive Allele Specific PCR） 通过引物末端特异性碱基
4、竞争性匹配 DNA 模板实现 SNP 基因分型的链式聚合酶反应。 3.4 品种纯度 varietal purity 品种在 DNA 分子标记基因分型方面一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占 供检 样品种子总 数的百分率表示。 DB32/T 3860 2020 2 4 原理 玉米基因组中普遍存在着单碱基的变异，不同品种 同一 SNP 位点的 基因型 可利用适宜引物通过 KASP 检出，进而根据 SNP 位点基因型的差异 鉴定 品种及纯度。 5 仪器设 备及试剂 见附录 A。 6 引物信息 见附录 B。 7 操作步骤 7.1 样品 DNA 提取 7.1.1 样品准备 试验样品 种子的分样与 保
5、存 ，应符合 GB/T 3543.2的规定。 7.1.2 用于 品种 鉴定样品 DNA 提取 从送检样品中随机抽取 10 粒种子发 苗 。 分单株剪取 100 mg 幼苗 用液氮研磨， 将研磨粉末转入 2 mL 离心管， 加入 0.5 mL 2CTAB 提取缓冲液充分混匀。在 55 65 恒浴 30 min。加入 1 mL 氯仿 :异戊 醇（ 24： 1），充分摇动 5 min， 8 000 g，室温下离心 5 min。取上清液加入 0.6体积异丙醇，室温下 静 置 30 min， 5 000 g， 4 离心 5 min。沉淀用 0.8 mL 高盐缓冲液充分溶解， 15 000 g 离心 2
6、min。 上清 加入 0.6体积异丙醇，室温下 静置 30 min， 5 000 g， 4 离心 5 min。沉淀用 400 L 双蒸水溶解，加 入 2.5体积 95% 的 预冷 乙醇， 20 冰箱 放置 2 h 以上， 15 000 g 离心 20 min。用 70% 的 预冷 乙醇洗 一次，自然干燥后，用 200 L 0.1TE 缓冲液溶解 ， 置 4 保存 。 注： 以上为推荐用于 品种 鉴定的 DNA 提取方法 ， 其他能够达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法都适用于本标 准。 7.1.3 用于纯度鉴定样品 DNA 提取 按 GB/T 3543.4规定的方法，从送检样品中抽取
7、 不少于 100 粒种子 发苗 。分单株剪取 0.5 cm 1 cm 长的幼苗，放入 96 孔 PCR 板的孔中，每孔 1 株幼苗样品。每孔加入 40 L DNA 提取试剂盒 缓冲液， 在沸水中 煮沸 30 s，然后加入 60 L DNA 提取试剂盒 缓冲液，在沸水中煮沸 2 min， 置 4 保存，保 存不超过 7 d。 注： 以上为推荐用于纯度鉴定的 DNA 提取方法 ， 其他能够达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法都适用于本标 准。 7.2 PCR 扩增 7.2.1 引物筛选 用于品种及纯度鉴定的 40 组 推荐引物及其序列参见附录 B。 DB32/T 3860 2020 3
8、自行筛选引物时，取 送检杂交种及 父 、 母本种子各 5 粒 ，通过 KASP 对 一系列 SNP 分子标记引物 进行筛选，确定适宜的引物。适宜引物应为能够清晰区分杂交种及其父、母本的共显性 引物 。 7.2.2 PCR 反应体系 在 5 L 的反应 体系 中进行 扩增。 反应 体系 包含 0.07 L 引物 KASP Assay mix， 2.5 L 2KASP Master mix， 50 ng 模板 DNA。扩增反应条件为： PCR 程序为 94 预变性 15 min； 94 变性 20 s， 61 退火和延伸 60 s， 10个循环 , 每个循环降低 0.6 ； 94 变性 20 s，
9、 55 退火和延伸 60 s， 26 个循 环。反应 利用 96 孔 PCR 板 在 PCR 扩增仪上进行。 7.3 基因分型检测 在微孔板荧光分析仪上读取荧光信号 , 使用 荧光结果处理 软件按照分型明确、 NTC (无样品阴性对 照 )无特异性扩增的原则进行样品 SNP 分型。 7.4 数据采集与 判定 7.4.1 数据记录 纯合位点的基因型数据记录为 X/X 和 Y/Y，其中 X、 Y 为 同一 位点上两个不同的等位变异；杂合 位点的基因型数据记录为 X/Y； 缺失位点等位变异数据记录为 -/-。 7.4.2 品种 鉴定 的 判定 根据送检样品在 40 个 SNP 位点基因型的差异 进行
10、品种鉴定 ， 具体判定 标准 如下： 差异位点数 4，判定为不同品种； 差异位点数 1 且 3，判定为 近似 品种； 差异位点数 = 0，判定为 极近似或相同 品种 。 对利用附录 B 中 40 组 引物仍未检测到 4 个差异位点数的样品，必要时可增加 自 行筛选引物 进行 检测。 7.4.3 纯度鉴定 的判定 品种纯度 按照下列公式计算 ： 品种纯度 %（自交系） =（供检种子粒数 -非本品种种子粒数） /供检种子粒数 100% 品种纯度 %（单交种） =（供检种子粒数 -母本种子粒数 -其他类型种子粒数） /供检种子粒数 100% DB32/T 3860 2020 4 A A 附 录 A
11、（ 规范 性附录） 仪器设备及 试剂配制 A.1 仪器设备 仪器设备包括： 微孔板荧光分析仪； PCR 扩增仪； 电子天平（感量 0.01 g， 0.001 g）； 冰箱； 微量加样器（ 0.1 L 2.5 L, 0.5 L 10 L, 20 L 200 L, 100 L 1 000 L ）； 磁力搅拌器； 高压灭菌锅； 酸度计等； 离心管（ 0.5 mL， 1.5 mL）； 吸头 (10 L ， 200 L ， 1 000 L)； 96 孔 PCR 板；封板膜； 一次性手套； 离心管架； 水平仪。 A.2 试剂 配制 A.2.1 DNA 提取试剂 称取 1 g 氢氧化钠溶于 99 mL 水中
12、。 A.2.2 DNA 提取试剂 取 10 mL 12 mol/L 的盐酸溶于 470 mL 水中即成 0.25 mol/L 盐酸。将 0.25 mol/L 盐酸与 0.5 mol/L Tris (PH8.0)按 2： 1 稀释。 A.2.3 1 mol/L Tris 溶液 (PH8.0) 称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷（ Tris），加入 800 mL 双蒸水中溶解，加入浓盐酸 58.4 mL，加水 定容至 1 000 mL。 A.2.4 0.5 mol/L EDTA 溶液（ PH8.0） 称取 186.6 g 乙二胺四乙酸二钠（ Na2EDTA2H2O） ， 加入 700 mL 双
13、蒸水中溶解，加入 20 g 氢氧 化钠，加水定容至 1 000 mL。 A.2.5 2CTAB 提取缓冲液 DB32/T 3860 2020 5 2% CTAB（ w/v） ， 100 mmol/L Tris(pH8.0)， 20 mmol/L EDTA (pH8.0)， 1.4 mol/L 氯化钠 ， 1% PVP Mr40 000。称取 20 g 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)， 81.9 g 氯化钠 ， 10 g 聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）， 加入 100 mL 1 mol/L Tris溶液 (PH8.0)和 40 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（ PH8.0），加水定容至
14、 1 000 mL。 A.2.6 高盐缓冲液 10 mmol/L Tris (pH8.0)， 1 mmol/L EDTA (pH8.0)， 1 mol/L 氯化钠。称取 58.5 g 氯化钠 ,加入 10 mL 1 mol/L Tris 溶液 (PH8.0)和 2 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（ PH8.0），加水定容至 1 000 mL。 A.2.7 0.1xTE 缓冲液 1 mmol/L Tris(pH8.0)， 0.1 mmol/L EDTA (pH8.0)， 1 mL 1 mol/L Tris 溶液 (PH8.0)和 0.2 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（ PH
15、8.0），加水定容至 1 000 mL。 A.2.8 2KASP Master mix 试剂 包含 TaqDNA 聚合酶、带有荧光的接头序列、镁离子、四种脱氧核糖核苷酸（ dNTP）， ROX 内参 荧光染料。 A.2.9 KASP Assay mix 包含 46 L ddH2O、 12 L 100 mol/L 特异性引物 F1、 12 L 100 mol/L 特异性引物 F2、 30 L 100 mol/L 通用引物。 DB32/T 3860 2020 6 B B 附 录 B （ 规范 性附录） 推荐使用的 40 组 SNP 引物 序列及其玉米 基因组分布 推荐使用的 40 组 SNP 引物
16、 序列及其 玉米 基因组分布见表 B.1。 表 B.1 40 组 SNP 引物 序列及其玉米基因组分布 引物名称 染 色 体 引物序列（ 5-3） PCR 扩增序列（ bp） b 正向 a 反向（通用） 起始位置 终止位置 扩增长度 JAASKASP1 1 catgtaaataggaaccttgttctcgtA atgtaaataggaaccttgttctcgtC agtcactcaaacatgttcgttgtccaaa 44378152 44378207 56 JAASKASP2 1 tgcattggctgacatggtaC tgcattggctgacatggtaG acttgcagaagc
17、tccagagt 112337393 112337472 80 JAASKASP3 1 agcataactaggacaaccattgaT agcataactaggacaaccattgaG ggaactaatggcacggttcc 158201133 158201187 55 JAASKASP4 1 aacatgtgatggtttgggtatgG aacatgtgatggtttgggtatgC cattcgtcaatgatgtgcagct 292751231 292751280 50 JAASKASP5 2 cctcctcccaacaatgtcagcA ctcctcccaacaatgtcagcG
18、 gattgtttrtgccatataacttgcaggttt 2501058 2501109 52 JAASKASP6 2 agcattctacatgtcgcgcA agcattctacatgtcgcgcC ggagaacctcgtcgatagcg 87519721 87519771 51 JAASKASP7 2 ttgaaatgttacgaatgtaaggacT ttgaaatgttacgaatgtaaggacC ggctgctctaaattacggca 126341825 126341878 54 JAASKASP8 2 ccactagcagaagcaatgcaaA ccactagcag
19、aagcaatgcaaG gcacacagtttggtgacatgt 236173255 236173312 58 JAASKASP9 3 acatgaagaagagccacgaA acatgaagaagagccacgaG tgcttccagttccaagctcc 10692209 10692274 66 JAASKASP10 3 cctccactttgtcatcgttccA cctccactttgtcatcgttccT tgtgtgccattaatgatgcact 65791039 65791096 58 JAASKASP11 3 tcgagtagtgtaagtggtagcaA tcgagt
20、agtgtaagtggtagcaC acgaattcttgtgctcccca 169180051 169180133 83 JAASKASP12 3 gctagagatccaagatttgtttgtT gctagagatccaagatttgtttgtC gtgaagacggtcgtttgtgc 210902615 210902685 71 JAASKASP13 4 tcacctccttttccggcaaC tcacctccttttccggcaaG gctctgacttggaatgccca 6610435 6610485 51 JAASKASP14 4 gctcttgtgtattcgggcaC
21、gctcttgtgtattcgggcaG aacacatgaagcgagacgga 33728113 33728162 50 JAASKASP15 4 cagatctgattgcttgttattggtA cagatctgattgcttgttattggtG aggagtagctcgatcagatgt 170544513 170544564 52 DB32/T 3860 2020 7 表 B.1 40 组 SNP 引物 序列及其 玉米 基因组分布 （续） JAASKASP16 4 ttcccagatctacaacaggatgcA cccagatctacaacaggatgcG cagtgacrtca
22、ccaagcaatctaaagat 239014674 239014734 61 JAASKASP17 5 actttattgtccccagctagttttA actttattgtccccagctagttttG aaattagactgcggctgccc 32482005 32482082 78 JAASKASP18 5 agttagccactctaatctgtccaG tagttagccactctaatctgtccaA aagttaatctakattagctggccttcttgt 71875211 71875264 54 JAASKASP19 5 gcgagcttggattagatagtttg
23、A gcgagcttggattagatagtttgG ctctgcatgacaacctccga 147519030 147519087 58 JAASKASP20 5 cgtatcacaaactcgcacgatT cgtatcacaaactcgcacgatC tggatgaaagtggcgtttgc 174036061 174036119 59 JAASKASP21 6 cattgcaaggctcctgaacA cattgcaaggctcctgaacG ggaaccagagcgcaaacatag 6019073 6019170 98 JAASKASP22 6 acatactctcgacagat
24、tagttggA acatactctcgacagattagttggG tcgacgatcagttccgtagc 76399451 76399501 51 JAASKASP23 6 acctctttacaccccttcacaT acctctttacaccccttcacaG aggcaagccatggagtttct 81773959 81774036 78 JAASKASP24 6 ctgctatagtgctagttacatggtA ctgctatagtgctagttacatggtG cgagcagccgtgattttcaa 142274108 142274169 62 JAASKASP25 7
25、agcactgtgcaacagctaccaC cagcactgtgcaacagctaccaT tccaaaaccactgcaaacataaaggctaa 20258184 20258262 79 JAASKASP26 7 gcggaggtagaaatttgggttT gcggaggtagaaatttgggttA cggcggtggttttgattcag 84880827 84880895 69 JAASKASP27 7 gcatcaccaaagtcaccagtgcA catcaccaaagtcaccagtgcG gctgaagttggcgtcatgatggtta 103535778 10353
26、5829 52 JAASKASP28 7 tagcagagctgatcggagcC tagcagagctgatcggagcA tacaagtggtcgtgcgtctt 161388164 161388221 58 JAASKASP29 8 acgaccagatccatgaaaaggatA acgaccagatccatgaaaaggatC tcgacgacaagatgtgggtg 32864435 32864490 56 JAASKASP30 8 agtggttgtttctagccaacA agtggttgtttctagccaacC aaagcagccaaacagaccct 89475855 8
27、9475917 63 JAASKASP31 8 tgttattggtggggtgggaA tgttattggtggggtgggaC ttccaccgtccaacagacat 101970990 101971039 50 JAASKASP32 8 ccggttcgatgccacacatA ccggttcgatgccacacatC ggtttgatgcaccaccacac 174841089 174841175 87 JAASKASP33 9 aagcacacctcaggctggaC aagcacacctcaggctggaT gccagctatcatccacaggg 16682227 166822
28、91 65 JAASKASP34 9 catctgttaagttaaggcccttatA catctgttaagttaaggcccttatC gccaagatgggaggtttgga 66329423 66329476 54 JAASKASP35 9 atacgcacagcaggtcagcA atacgcacagcaggtcagcG ccaggaggagacaggatgga 104360117 104360193 77 DB32/T 3860 2020 8 表 B.1 40 组 SNP 引物 序列及其 玉米 基因组分布 （续） JAASKASP36 9 cggaggagacctgaatcatc
29、taG cggaggagacctgaatcatctaA agccaaacgacatgaagggt 145631702 145631773 72 JAASKASP37 10 gcatctgggactgctctgaT gcatctgggactgctctgaC gccccagctgtcctactgta 16577851 16577908 58 JAASKASP38 10 ggggattcgaaccaaaccaG ggggattcgaaccaaaccaA ccgatctgtttcgcagccta 63062898 63062951 54 JAASKASP39 10 agtgtgctcctttggaaaacT agtgtgctcctttggaaaacC cgtcgtgcttgtcttctcca 106331559 106331613 55 JAASKASP40 10 agacgccaaatgactaaatccaA agacgccaaatgactaaatccaG gagcaaccagtttccccagt 144274187 144274242 56 a 每组正向引物上面序列 为 F1，由 FAM 荧光标 记；下面序列为 F2，由 HEX 荧光标记；变异碱基由序列尾部 大写字母表示。 b 起始及终止位置基于 B73 参考基因组（ V3）。 _
