1、ICS 65.150 B 51 DB32 江苏 地方标准 DB32/T 3771 2020 渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定 液相色谱 -串联质谱法 Determination of quinolones in aquaculture water by LC-MS/MS 2020 - 04 - 08 发布 2020 - 05 - 15 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/T 3771 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业农村厅提出。 本标准由江苏省渔业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：江苏省淡水水产研究所、江苏省水产质量
2、检测中心。 本标准主要起草人：孟勇、沈美芳、朱晓华、杨洪生、王静、张美琴、谭秀慧、刘崇万、王凯、朱 凛。 DB32/T 3771 2020 1 渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素 测定 液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本标准规定了渔业养殖用水中 16种喹诺酮类抗生素残留量的前处理和液相色谱 -串联质谱测定方 法。 本标准适用于渔业养殖用水中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙 星、 依诺沙星、洛美沙星、萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、丹诺沙星、双氟沙星、奥比沙星、司帕沙星、氟罗沙 星 16种抗生素残留量的测定。 2 规范性 引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引
3、用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 水样用混合纤维素滤膜过滤后，喹诺酮类抗生素经固相萃取柱富集、 洗脱和 净化 后， 供液相色谱 - 串联质谱仪测定，内标法定量。 4 试剂和材料 4.1 甲 醇 （ CH3OH） 。 4.2 乙腈 （ CH3CN） 。 4.3 甲酸 （ HCOOH） 。 4.4 乙酸铵 （ CH3COONH4） 。 4.5 氨水 （ NH3H 2O） ：优级纯。 4.6 5 mmol/L 乙酸铵缓冲液：称 取 0.1925 g 乙酸铵（ 4.
4、4），溶于 500 mL 水中 。用 甲酸（ 4.3）调节 pH 为 30.05。 4.7 5%氨水 甲醇溶液：量取 5 mL氨水（ 4.5），用甲醇 稀释并定容至 100 mL。 4.8 0.1%甲酸水溶液：量取 1 mL 甲酸（ 4.3），用水稀释至 1000 mL。 4.9 0.1%甲酸水 -乙腈：（ 9+1，体积比），量取 90mL0.1%甲酸水 溶液 （ 4.8）和 10mL 乙腈（ 4.2）混 合。 4.10 标准物质： 恩诺沙星（ Enrofloxacin）、诺氟沙星（ Norfloxacin） 、培氟沙星（ Pefloxacin） 、环 丙沙星（ Ciprofloxacin）
5、、氧氟沙星（ Ofloxacin） 、沙拉沙星（ Sarafloxacin） 、依诺沙星（ Enoxacin） 、 洛美沙星（ Lomefloxacin） 、萘啶酸（ Nalidixic acid） 、恶喹酸（ Oxolinic acid） 、氟甲喹（ Flumequine） 、 丹诺沙星（ Danafloxacin） 、双氟沙星（ Difloxacin） 、奥比沙星（ Orbifloxacin） 、司帕沙星（ Sparfloxacin） 、 氟罗沙星（ Fleroxacin） ，纯度 97.0%。 DB32/T XXXX 2020 2 4.11 内标物质：氘代诺氟沙星，氘代环丙沙星、氘代恩诺
6、沙星， 纯度 97.0%。 4.12 喹诺酮类标准储备溶液：分别称取适量喹诺酮类标准品（ 4.10），用甲醇 (4.1)溶解并定容至 10 mL， 使各种喹诺酮的浓度均为 1.0 mg/mL。 -18 以下避光保存，有效期 6 个月。 4.13 内标标准储备溶液：分别称取适量内标标准品（ 4.11），用甲醇 (4.1)溶解并定容至 10 mL，使各 种内标浓度均为 1.0 mg/mL。 -18 以下避光保存，有效期 6 个月。 4.14 混合标准 中间 溶液：分别量取适量标准储备溶液 (4.12)于 100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀释配制 成浓度为 1 g/mL 的混合标准 中间 溶液。
7、-18 以下避光保存，有效期 3 个月。 4.15 混合标准工作溶液：根据需要用 0.1%甲酸水 -乙腈（ 4.9） 由混合标准中间液（ 4.14）稀释成合适 的混合标准工作溶液，现配现用。 4.16 混合内标 标准工作溶液：分别量取 适量 标准储备溶液 (4.13)于 100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释 配制成浓度为 1 g/mL的混合 内标 标准工作溶液。 -18 以下避光保存，有效期 3个月 。 注： 除另有说明外，以下所用的试剂均为色谱纯，试验用水为 GB/T 6682 规定的一级水。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱 -串联四极杆质谱仪，配电喷雾离子源 (ESI)。 5.2 天平：
8、感量 0.01 g。 5.3 分析天平：感量 0.00001 g。 5.4 涡旋混合器。 5.5 氮吹仪。 5.6 pH计：测量精度 0.05。 5.7 刻度玻璃离心管： 10 mL。 5.8 混合纤维素滤膜： 0.45 m。 5.9 水系 滤膜： 0.22 m 。 5.10 固相萃取柱： HLB 固相萃取柱： 500 mg， 6 mL，或性能相当者 。 5.11 固相萃取装置。 6 样品制备与保存 采集的 渔业养殖水 样 经 0.45 m 混合纤维素滤膜 过滤。 如水样较浑浊，可更换滤膜或过滤 2次。过滤 后的水样于 4 密封保存， 24 h内进行检测 。 取 过滤后的 供试样品，作为供试
9、试料。 取 过滤后的 空白样品，作为空白 试料 。 取过滤 后的空白样品 ， 添加适宜浓度 的 标准 工作 液 ， 作为空白添加试料。 7 测定步骤 7.1 提取和净化 依次用 6 mL甲醇 ， 6 mL超纯水， 6 mL 5 mmol/L乙酸铵缓冲液 （ 4.6） 活化 小柱（ 5.10） 。量取 200 mL 过滤后的 试样，加入适量 甲 酸调节水样 pH为 3.00.05， 准 确 加入 1g/mL混合 内标 标准工作液 50 L （ 4.16）。 然后以约 35 mL/min流速通过固相萃取柱 （ 5.10） 。 过柱后 用 6 mL超纯水 淋洗，再将小柱于 氮气保护下干燥 20 mi
10、n，最后用 6 mL5%氨水甲醇溶液（ 4.7） 分两次进行洗脱。洗脱液 于 40 水浴用氮 DB32/T 3771 2020 3 气吹至近干，用 0.1%甲酸水 -乙腈（ 4.9） 定容至 1 mL，涡旋混匀 1 min，过 0.22 m 水系 滤膜，供液相色 谱 -串联质谱仪测定。 7.2 标准曲线的制备 精 确 量取适量混合标准 中间溶 液 (4.14)和适量 1 g/mL 混合 内标 标准工作液（ 4.16） ，用 0.1%甲酸 水 -乙腈（ 4.9） 配制 成同位素内标浓度为 50 ng/mL 以及 16 种喹诺酮 浓度为 1、 5、 10、 20、 50、 100 和 200 ng
11、/mL 系列标准溶液。以被测组分 和相应内标 的峰面积 比值 为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲 线 ， 计算回归方程和相关系数。 7.3 测定 7.3.1 色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a) 色谱柱 ： EC-C18 柱， (2.1 mm x100 mm， 2.7 m)，或性能相当者。 b) 流速： 0.40 mL/min。 c) 柱温： 30 。 d) 进样量： 10 L。 e) A 为 0.1%甲酸水溶液 (4.8)， B 为 乙腈 (4.2)；梯度洗脱程序见 表 1。 表 1 流动相梯度洗脱程序 时间 /min A相 /% B相 /% 0.00 95 5 2.00 85 15
12、10.00 45 55 12.00 10 90 13.00 95 5 15.00 95 5 7.3.2 质谱参考条件 质谱参考 条件如 下： a) 离子化模式： 电喷雾离子源 (ESI)，正离子模式 ； b) 喷雾电压： 5500 v； c) 气帘气 流量： 2 L/min； d) 雾化气流量： 8 L/min； e) 辅助加热气流量： 8 L/min； f) 离子 源 温度： 500 ； g) 扫描模式： 多反应 监测 (MRM)， 扫描参数见附录 A； 7.3.3 定性测定 在同样测试条件下，试样溶液中各抗生素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在 2.5%以内， 且检测到的定性离子的相对
13、丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致。基峰与次强 碎片离子丰度比应符合表 2 要求。 各抗生素的保留时间参考附录 B。 DB32/T XXXX 2020 4 表 2 基峰与次强碎片离子丰度比要求 次强碎片离子相对丰度 % 50 20 50 10 20 10 允许相对偏差 % 20 25 30 50 7.3.4 定量测定 将标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按 内标法进行定量分析，在样品中加入回收率指示物， 以此来保证整个样品前处理过程的回收率。诺氟沙星、依诺沙星以氘代诺氟沙星为内标，环丙沙星、 洛美沙星以氘代环丙沙星为内标，恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、司
14、帕沙星、 双氟沙星、恶喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟罗沙星、奥比沙星以 氘代恩诺沙星为内标。 7.3.5 空白试验 除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。 8 结果计算 试样中 喹诺酮类抗生素含量 按公式 (1)计算 ， 计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字。 （ 1） 式中： Xi 试样中喹诺酮类抗生素含量， 单位为纳克每升 (ng/L)； ci 试样溶液 中喹诺酮类抗生素的浓度， 单位为纳克每毫升 (ng/mL)； V1 试样溶液最终体积， 单位为毫升 (mL)； m 试样体积，单位为升 (L)。 9 方法灵敏度、准确度 和精密度 9.1 灵敏度 本方法的 定量限为 10 ng/L。
15、9.2 准确度 本方法回收率范围为 70% 120%。 9.3 精密度 本方法的批内变异系数 15%，批间变异系数 15%。 mVcX ii DB32/T 3771 2020 5 附 录 A （资料性附录） 扫描参数 表 A.1 16种喹诺酮类抗生素及内标物的母离子、子离子和碰撞能量 序号 化合物 母离子 /(m/z) 子离子 /(m/z) 碰撞能 量 /V 1 恩诺沙星 360 245 38 316* 26 2 诺氟沙星 320 233 35 276* 26 3 培氟沙星 334 290 27 316* 30 4 环丙沙星 332 245 32 288* 26 5 氧氟沙星 362 261
16、26 318* 38 6 沙拉沙星 386 299 36 342* 26 7 依诺沙星 321 232 44 303* 30 8 洛美沙星 352 265 33 308* 28 9 萘啶酸 233.3 215.2 28 187.4* 44 10 恶喹酸 262 216 39 244* 26 11 氟甲喹 262 202 25 244* 40 12 丹诺沙星 358 283 30 340* 24 13 双氟沙星 400 299 38 356* 30 14 奥比沙星 396 295 35 352* 26 15 司帕沙星 393 292 35 349* 27 16 氟罗沙星 370 269 37 3
17、26* 27 17 氘代诺氟沙星 325 307 30 18 氘代环丙沙星 340 322 28 19 氘代恩诺沙星 365 321 29 注： *为定量离子 DB32/T XXXX 2020 6 附 录 B （资料性附录） 标准溶液 液相色谱 /串联质谱 色谱图和参考保留时间 X IC o f + M R M ( 3 5 p a ir s ): 3 7 0 .0 0 0 /3 26 .0 0 0 D a I D : F L E 1 f ro m S a m p l e 2 ( S T D 2 0 n g/ m L ) o f 2 0 18 0 5 2 3 .w if f (T ur b o
18、S p ra y ) M a x . 6 .7 e 5 c ps . 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 T i m e, m i n 0. 00 1. 00e5 2. 00e5 3. 00e5 4. 00e5 5. 00e5 6. 00e5 7. 00e5 8. 00e5 9. 00e5 1. 00e6 1. 10e6 1. 20e6 1. 29e6 I n t e n s i t y , c p s 3. 76 图 B.1 16 种 喹诺酮 标准工作溶液液相色谱 /串联质谱 XIC 色谱图 图 B.2 16 种 喹诺酮 标准工作溶液液相色谱 /串联质谱 TIC 色谱图 DB32/T 3771 2020 7 表 B.1 16 种 喹诺酮 标准工作溶液 参考保留时间 化合物名称 保留时间 /min 化合物名称 保留时间 /min 依诺沙星 3.51 恩诺沙星 4.14 诺氟沙星 3.71 奥比沙星 4.25 氧氟沙星 3.72 沙拉沙星 4.75 氟罗沙星 3.76 司帕沙星 4.77 培氟沙星 3.78 双 氟沙星 4.84 环丙沙星 3.82 恶喹酸 5.85 丹诺沙星 3.93 萘啶酸 7.40 洛美沙星 3.96 氟甲喹 7.99 _
