1、ICS 65.020.20B 05黑 龙 江 省 地 方 标 准DB23DB23/T 2685 2020水 稻 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 技 术 规 程 2020-09-11发 布黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布2020-10-10实 施 DB23/T 2685-2020 I 前 言本 标 准 依 据 GB/T 1.1-2009编 写 规 则 起 草 。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 厅 提 出 。本 标 准 由 黑 龙 江 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 黑 龙 江 省 农 业 科 学 院
2、耕 作 栽 培 研 究 所 、 中 国 科 学 院 遗 传 与 发 育 生 物 学 研 究 所 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 来 永 才 、 朱 祯 、 王 锋 、 孟 英 、 唐 傲 、 张 磊 、 张 喜 娟 、 李 平 、 董 文 军 、 陈 在 杰 、刘 猷 红 、 王 立 志 、 陈 丽 华 、 姜 树 坤 、 刘 凯 、 刘 琦 、 姜 辉 、 任 洋 、 董 德 建 。 DB23/T 2685-2020 1 水 稻 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 水 稻 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 技 术 的 术 语 和
3、 定 义 、 基 本 要 求 、 技 术 流 程 和 操 作 步 骤 。本 标 准 适 用 于 水 稻 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB/T 17316 水 稻 原 种 生 产 技 术 操 作 规 程 GB/T 19489 实 验 室 生 物 安
4、全 通 用 要 求3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 遗 传 性 状 定 向 突 变对 目 的 基 因 特 定 DNA片 段 进 行 突 变 ， 使 遗 传 性 状 发 生 定 向 突 变 的 操 作 技 术 。3.2 定 向 突 变 系 统遗 传 性 状 定 向 突 变 技 术 主 要 使 用 的 是 CRISPR/Cas系 统 。 CRISPR/Cas系 统 是 成 簇 的 规 律 间 隔 的 短 回 文重 复 序 列 /成 簇 的 规 律 间 隔 的 短 回 文 重 复 序 列 关 联 蛋 白 系 统 ， 其 广 泛 存 在 于 细 菌 及
5、 古 生 菌 中 , 是 机 体 长期 进 化 形 成 的 RNA指 导 的 降 解 入 侵 病 毒 或 噬 菌 体 DNA的 适 应 性 免 疫 系 统 。 4 基 本 要 求4.1 设 施 和 设 备实 验 室 设 施 、 设 备 和 试 验 场 所 符 合 GB/T 19489中 生 物 安 全 防 护 水 平 一 级 的 要 求 。4.2 操 作 人 员实 验 操 作 人 员 应 通 过 必 要 的 实 验 技 术 和 生 物 安 全 管 理 规 范 的 培 训 。4.3 记 录应 包 括 但 不 限 于 试 验 开 始 和 结 束 的 时 间 ， 材 料 名 称 、 来 源 、 编
6、号 、 保 存 信 息 、 目 的 基 因 序 列 信 息 、载 体 结 构 、 表 型 鉴 定 和 突 变 后 代 的 检 测 结 果 等 。4.4 其 他 利 用 遗 传 性 状 定 向 突 变 技 术 进 行 水 稻 育 种 的 过 程 应 符 合 相 应 法 律 法 规 的 规 定 。 DB23/T 2685-2020 2 5 技 术 流 程技 术 流 程 应 符 合 图 1 规 定 ： 图 1 遗 传 性 状 定 向 突 变 育 种 技 术 流 程 图6 操 作 步 骤6.1 目 标 基 因 突 变 位 点 设 计比 对 受 体 材 料 全 基 因 组 序 列 ， 根 据 目 标 性
7、 状 基 因 的 来 源 、 序 列 和 载 体 启 动 子 的 种 类 选 择 适 合 的 软 件设 计 基 因 上 的 突 变 位 点 。6.2 定 向 突 变 载 体 的 构 建对 基 因 进 行 突 变 位 点 预 测 ， 设 计 相 应 引 物 。 根 据 遗 传 性 状 定 向 突 变 的 方 式 和 对 象 选 择 适 宜 的 载 体 ，经 酶 切 线 性 化 、 T4 连 接 酶 进 行 连 接 、 转 化 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 和 测 序 鉴 定 ， 构 建 CRISPR/Cas9 表 达 载体 。 6.3 遗 传 工 程 转 化将 正 确 连 接 的 重 组
8、载 体 转 化 至 农 杆 菌 ， 利 用 农 杆 菌 介 导 的 方 法 转 化 受 体 水 稻 的 愈 伤 组 织 ， 筛 选 培 养获 得 再 生 的 水 稻 植 株 。6.4 突 变 体 的 筛 选 和 鉴 定6.4.1 筛 选 鉴 定 引 物 的 设 计根 据 筛 选 标 记 、 载 体 特 异 序 列 、 目 的 基 因 序 列 和 突 变 位 点 ， 利 用 专 业 软 件 设 计 检 测 引 物 。6.4.2 突 变 植 株 的 鉴 定提 取 突 变 当 代 水 稻 的 基 因 组 DNA， 利 用 筛 选 标 记 和 载 体 特 征 引 物 对 突 变 后 代 进 行 PCR
9、扩 增 ， 均 能 扩增 出 目 的 条 带 的 为 突 变 植 株 。 6.4.3 突 变 位 点 分 析对 突 变 植 株 的 基 因 突 变 位 点 区 域 进 行 测 序 ， 鉴 定 突 变 位 点 的 突 变 类 型 ， 选 择 有 效 的 突 变 类 型 单 株 进行 种 子 收 获 并 继 续 种 植 。 DB23/T 2685-2020 3 6.4.4 突 变 体 表 型 分 析从 有 效 的 定 向 突 变 体 后 代 中 选 择 纯 合 株 系 进 行 突 变 位 点 表 型 测 定 和 主 要 农 艺 性 状 调 查 ， 田 间 记 载 项目 参 考 GB/T 17316 执 行 ， 结 合 突 变 位 点 遗 传 稳 定 性 的 验 证 ， 可 获 得 稳 定 的 遗 传 性 状 定 向 突 变 水 稻 。
