1、 ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 3172.32020 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PCR 检测 第 3 部分：H3N8 亚型马流感病毒 Real-time RT-PCR detection on HA and NA genes of influenza virus Part 3： H3N8 subtype equine influenza virus 2020 - 10 - 14 发布 2020 - 10 - 30 实施 吉林省市场监督管理厅 发布 DB22/T 3172.3 2020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和
2、GB/ T 20001.4-2015给出的规则起草。 DB22/T 3172流感病毒HA和NA 基因检测 荧光RT-PCR法分为四个部分。 第 1 部分：H7N9亚型禽流感病毒； 第 2 部分：H7N4亚型禽流感病毒； 第 3 部分：H3N8亚型马流感病毒； 第 4 部分：H7N7亚型马流感病毒。 本部分为DB22/T 3172的第 3 部分。 本部分由长春海关提出并归口。 本部分起草单位：长春海关技术中心。 本部分主要起草人：王伟利、王准、王玮琳、姚贵哲、刘金华、肖芳、李玥、马文晨、杨帆、蔡阳、 马玲。 DB22/T 3172.3 2020 1 流感病毒 HA 和 NA 基因荧光 RT-PC
3、R 检测 第 3 部分：H3N8 亚型马流感病毒 1 范围 本标准规定了H3N8亚型马流感病毒HA和NA基因荧光RT-PCR检测方法的原理、 试验条件、 试剂与材料、 仪器设备、样品、试验步骤和试验数据处理及试验报告。 本标准适用于H3N8亚型马流感病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 Ct值：每个反应管内的荧
4、光信号达到的设定的阈值时所经历的循环数（Cycle threshold） DEPC：焦磷酸乙二酯（Diethy py rocarbonate） HA： 血凝素（Hemagglutinin） NA： 神经氨酸酶（Neuraminidase） RNA：核糖核酸（Ribon ucleic acid） RT-PCR： 反转录聚合酶链反应（Reverse tr anscription-polymerase chain reaction） Taq 酶： Taq 脱氧核糖核酸聚合酶（ Thermusaquaticus DNA polymerase） 4 原理 根据H3N8 亚型马流感病毒HA基因和NA基因序
5、列设计特异引物和探针，探针结合部位在扩增片段内 部。HA基因和NA基因探针分别在5 端标记FAM和CY3荧光素作为报告荧光基团，3 端分别标记MGB和BHQ1 作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团 发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时， Taq酶发挥 5 3的外切核酸酶功能，将探针降解，探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所 吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。据 此荧光PCR仪可实现对HA基因和NA基因的同步实时检测。 5 试
6、验条件 DB22/T 3172.3 2020 2 5.1 生物安全措施 所有培养物和废弃物的处置应按照GB 19489中的有关规定执行。 5.2 防污染措施 防止污染措施应符合GB/T 27401的规定。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 阴性对照：可采用经灭活的不含马流感病毒的鸡胚尿囊液。 6.1.2 阳性对照：非感染性体外转录 RNA，-20 保存备用。 6.1.3 2RT-PCR Buffer。 6.1.4 RT Enzyme Mix。 6.1.5 Taq 酶。 6.1.6 DEPC 水：0.1% DEPC 处理后的去离子水。 6.1.7 引物与探针：见表 1 。 表1 H3N8
7、 亚型马流感病毒 HA 基因和 NA 基因引物和探针 引物 F1 5 TGGATTTCATTTGCCATATCAT3 引物 R1 5 GCAAATGTTGCATCTAATRTTG3 HA 基因 探针 P1 FAMTGGCAGGCCCACATMGB 引物 F2 5 CTCCAAGAGGGGAAGATGCT3 引物 R2 5 CTGACCTGGAGGTTCGACTA3 NA 基因 探针 P2 CY3CGCCCCACCCACACATCAGTTCCCTGTBHQ1 6.2 材料 6.2.1 离心管（1.5 mL、0.2 mL）。 6.2.2 荧光 PCR 反应管（0.1 mL、0.2 mL）。 7 仪
8、器设备 7.1 生物安全柜。 7.2 高速冷冻离心机（13 000 r/min）。 7.3 微量可调移液器 (2.5 L、10 L、100 L、1 000 L)。 7.4 超低温冰箱（-80 ）。 7.5 荧光定量 PCR 仪（至少包含 FAM 和 VIC 通道）。 7.6 旋涡振荡器。 7.7 高压灭菌器。 8 样品 DB22/T 3172.3 2020 3 8.1 采集 将拭子经前侧鼻道伸入鼻腔深部蘸取呼吸道黏液，取出后立即放入盛有2.0 mL PBS液（含有青霉素 和链霉素）的采样管中，编号。 8.2 运输与储存 鼻拭子样品在2 8 条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70
9、 冰箱中，但应避 免反复冻融。 9 试验步骤 9.1 核酸提取 采用市售RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪及配套核酸提取试剂进行提取。 9.2 荧光 RT-PCR 检测 9.2.1 反应体系 在PCR溶液配制区，反应体系配制见表2与表3，每份检测样品的荧光RT-PCR体系为25 L。用旋涡 振荡器进行混匀，瞬间离心后置荧光PCR仪扩增。 表2 H3N8 亚型马流感病毒 HA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 用量 L 2RT-PCR Buffer（ 6.1.3） 12.5 RT Enzyme Mix 5 U/L（ 6.1.4） 0.5 Taq 酶 5 U/L（ 6.1.5） F1 10
10、mol/L（ 6.1.7） 10 R1 10 mol/L（ 6.1.7） P1 15 mol/L（ 6.1.7） 模板 RNA 5.0 DEPC水（ 6.1.6） 3.5 总计 25 表3 H3N8 亚型马流感病毒 NA 基因荧光 RT-PCR 反应体系 成分 用量 L 2RT-PCR Buffer（ 6.1.3） 12.5 RT Enzyme Mix 5 U/L（ 6.1.4） 0.5 Taq 酶 5 U/L（ 6.1.5） F2 10 mol/L（ 6.1.7） 10 R2 10 mol/L（ 6.1.7） P2 15 mol/L（ 6.1.7） 模板 RNA 5.0 DEPC水（ 6.1
11、.6） 3.5 总计 25 DB22/T 3172.3 2020 4 9.2.2 反应参数 9.2.2.1 第 1 阶段，反转录 45 30 min。 9.2.2.2 第 2 阶段，预变性 92 3 min。 9.2.2.3 第 3 阶段，92 15 s，53 20 s，60 30 s（在此收集荧光），40 个循环。 10 试验数据处理 10.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根 据仪器噪音情况进行调整。 10.2 质控标准 10.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 10.2.2 阳性对照的 Ct 值应30.0，
12、并出现特定的扩增曲线。 10.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。 10.3 结果判定 10.3.1 阴性 无Ct值且无扩增曲线，或只出现单一通道有荧光信号，均判为阴性。报告样品中不存在 H3N8 亚型 马流感病毒核酸。 10.3.2 阳性 Ct值均30.0，且HA基因与NA基因同时扩增出特定的扩增曲线，判为阳性，报告样品中存在H3N8 亚型马流感病毒核酸。 10.3.3 有效原则 Ct值30.0的样本建议重做，重做结果无Ct者为阴性，否则为阳性。 11 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面的内容： a) 试验对象； b) 所使用的标准（包括发布或出版年号）； c) 所使用的方法（如果标准中包括多个方法）； d) 结果； e) 观察到的异常现象； f) 试验日期。 _
