1、ICS 67.050 CCS B 50/59 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3367 2021 海洋生物体中皮质醇的测定 Determination of hydrocortisone in marine organism 2021 - 01 - 30 发布 2021 - 03 - 02 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3367 2021 I 前 言 本 文件 按照 GB/T 1.1-2020给出的规则编写 。 本 文件 由 辽宁省农业农村厅 提出并 归口管理。 本 文件 主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院、大连海关技术中心、大连海洋学校 本 文件 主要起
2、草人：刘桂英、王琦、葛坤、田金、宋广军、胡超魁、邵泽伟、李安龙 本 文件 发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址： 辽宁省农业农村厅农产品质量安全监 管局（ 沈阳市和平区太原北街 2号综 合楼 A座 ），联系人：马京京，联系电话： 024-23447862； 13840306249， 电子邮箱 ： 文件 起草单位通讯地址： 辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街 50号 ），联系电话： 0411-84671027。 DB21/T 3367 2021 1 海洋生
3、物体 中 皮质醇的测定 1 范围 本 文件 规定了 海洋生物体中皮质醇检测的原理、试剂、仪器和设备、样品前处理、样品测定与结果、 方法灵敏度、准确度和精密度 。 本 文件 适用于鱼 类 、虾 类 、 棘皮类 、 贝类 生物体中皮质醇的测定 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 30891 水产品抽样 规范 3 方法原理 生物样品 中的
4、皮质醇，用 0.2%甲酸乙腈溶液提取，固相萃取柱净化、浓缩，超高效液相色谱质谱 联用仪 检测，外标法定量 。 4 试剂 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 甲酸： 色谱纯。 4.3 氯化钠：分析纯。 4.4 无水硫酸钠：分析纯。 4.5 0.1%甲酸 溶液： 用移液管量 取 1 mL 甲酸 ，用水稀释并定容至 1000 mL。 4.6 0.2%甲酸乙腈溶液：用移液管量取 1 mL 甲酸，用乙腈 （ 80%） 稀释并定容至 500 mL。 4.7 标准品：皮质醇（ hydrocortisone， C21H30O5， CAS 号 50-23-7，纯度 98% 以上 ） 。 4.8 标准贮备溶液 （ 1
5、0 mg/L） ：准确称取 1.00 mg 皮质醇标准品，用乙腈稀释至 10 mg/L，避光贮存 在 -18 下。 4.9 标准溶液 ( 1 mg/L )：准确吸取标准贮备溶液 1 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用 乙腈 定容， 避光冷 藏 贮存于 26 下。 4.10 针孔式 微孔滤膜： 0.22 m ，有机 系。（亲水性聚丙烯、玻璃纤维、亲水性 PTFE、聚醚砜或其 它等效材质） 4.11 除非另有说明，在分析中所使用的水均符合 GB/T 6682 规定的一级用水。 5 仪器和设备 DB21/T 3367 2021 2 5.1 超高 效液相色谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源 、 三重四
6、级杆。 5.2 固相萃取装置 ： 固相萃取柱 ， Captivate EMR（ 200 mg， 6cc）。 5.3 离心机 ： 转速： 5000r/min。 5.4 分析天 平：感量 0.0001 g 和 感量 0.01 g。 5.5 高速组织捣碎机。 5.6 均质机。 5.7 氮吹仪。 5.8 涡旋混匀仪。 6 测定 步骤 6.1 样品制备 与保存 6.1.1 水产品的 试样抽取：按 GB/T 30891 的规定执行。 6.1.2 水产品试样制备： 取样品约 100 g，用高速组织捣碎机充分捣碎， 均质机混匀， 均分成 2 份， 一份用于检测，另一份作为留样。 6.1.3 样品于 -18 下
7、冷冻避光存放 。 6.2 提取 称取 样品 5.00 g， 置于 50 mL 聚丙烯塑料离心管中，加入 10 mL 的 0.2%甲酸乙腈溶液，充分摇匀， 涡旋，加入 1 g 的氯化钠和 4 g 的 无水硫酸钠，充分涡旋混匀 1 min，超声 10 min，静置，以 5000 r/min 4 离心 15 min，取上清液 4 mL，放入空的聚丙烯塑料离心管中，加入 1 mL 水，混匀， 待净化。 6.3 净化和浓缩 将待 净化 溶液全部倒入固相萃取柱， 保持约每秒一滴的流速，收集全部流出液 (抽干 )， 45 水浴浓 缩氮吹仪氮吹至液面高度恒定，用水定容至 1 mL，上清液经有机滤膜 0.22
8、m过滤至进样瓶中，供 超高 效液相色谱质谱联用仪检测。 6.4 样品测定 参照下述条件进行测定： BEH C18 柱（ 2.150 mm i.d., 1.7 m ） ； 流动相 为 0.1% 甲酸水溶液 -乙腈，梯度洗脱顺序见 表 1； 进样量： 10 L； 柱温： 30 ； 流速 ： 0.2 mL/min。 表 1 梯度洗脱顺序 时间（ min） 0.1%甲酸水溶液（ %） 乙腈（ %） 初始 90 10 1.00 70 30 2.00 50 50 3.00 30 70 DB21/T 3367 2021 3 4.00 10 90 5.00 90 10 6.00 90 10 电离模式 电喷雾电
9、离，正模式。 扫描模式：多反应监测（ MRM）模式，监测离子对（ m/z）参见表 2。 表 2 质谱条件 化合物 离子模式 分子离子对 m/z 驻留时间 s 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 皮质醇 ESI+ 363.2121 363.2327 0.163 42 42 22 16 代表定量离子 6.5 标准曲线的绘制 吸取 标准溶液（ 4.9） 5 mL，用流动相逐级稀释，配制成浓度分别为 0、 5.0、 10.0、 20.0、 50.0、 100 g/L 的混合标准系列工作溶液，将此混合标准系列工作溶液按色谱 、质谱 条件测定，通过仪器工 作站制定外标法标准曲线 ，标准溶液总离子流色谱图参见附录
10、 A。 6.6 分析 将 样品溶液注入液相色谱质谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到样品溶液中皮质醇的质量浓度。 在同样测试条件下 ，样品溶液中皮质醇的保留时间与标准溶液中皮质醇的保留时间之间的偏差在 2.5%以内，且样品溶液中皮质醇的定性离子的相对丰度与质量浓度相近的标准溶液中 皮质醇的定性离子 的相对丰度一致，其丰度比偏差应符合表 3的要求，则可判定样品溶液中存在被测化合物。 表 3 定性离子相对丰度的最大允许偏差 定性离子相对丰度 50% 20% 50% 10% 20% 10% 允许的相对偏差 20% 25% 30% 50% 7 计算 试样 中皮质醇 的含量， 按下列公式 （ 1） 计算
11、，结果保留 3位有效数字，符合 GB/T 8170的数字修 约 要求。 X= mV 1000C .(1) X 试样中皮质醇含量，单位为微克每千克（ g/kg）； C 通过 标准曲线计算的 皮质醇 浓度，单位 为 微克每毫升（ g/mL） ； V 试样最终定容体积，单位为毫升（ mL） ； m 试样的称取量，单位为克（ g） 。 8 线性范围、灵敏度、精密度 DB21/T 3367 2021 4 8.1 线性 范围 皮质醇标准溶液线性范围为 0 g/L 100 g/L。 8.2 灵敏度 皮质醇 的检出限浓度为 0.11 g/kg ，定量限为 0.35 g/kg 。 8.3 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值 的 15%。 DB21/T 3367 2021 5 A A 附 录 A （资料性 ） 皮质醇总离子流色谱图 _ _ B
