1、ICS 13.020.40 Z 10 DB21 辽宁省 地 方 标 准 DB21/T 3286 2020 水质 5 种磺胺类抗生素的测定 固相萃取 /高效液相色 谱 -三重四极杆串联 质谱法 2020 - 08 - 30 发布 2020 - 09 - 30 实施 辽宁省市场监督管理局 发布 DB21/T 3286 2020 I 目 次 前 言 .II 1 适用范围 .1 2 规范性引用文件 .1 3 方法原理 .1 4 干扰和消除 .1 5 试剂 .1 6 仪器和设备 .2 7 样品 .2 8 分析步骤 .3 9 结果计算与表示 .5 10 精密度和准确度 .6 11 质量保证和质量控制 .7
2、 12 废物处理 .7 附录 A （资料性附录） 方法的精密度和准确度 .8 DB21/T 3286 2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。 本标准附录 A为资料性附录。 本标准由大连市市场监督管理局提出。 本标准由辽宁省生态环境厅归口。 本标准主要起草单位：辽宁省大连生态环境监测中心。 本标准主要起草人：付晓燕、刘莲莲、杨硕、杨萌。 本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址 ： 辽
3、宁省生态环境厅（沈阳市浑南区双园路 30甲），联系电话： 024-62788517。 标准起草单位通讯地址：辽宁省大连生态环境监测中心（辽宁省大连市沙河口区连山街 58号），联 系电话： 0411-84691900。 DB21/T 3286 2020 1 水质 5 种磺胺类抗生素的测 定 固相萃取 /高效液相色谱 -三重四极杆串联质谱法 警告：实验中所使用的甲醇、磺胺类抗生素属于有毒有机物，实验操作时应避免接触皮肤和衣物， 溶液配制过程应在通风橱内进行。 1 适用范围 本标准规定了测定水中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶 和 磺胺甲恶唑 等 5种磺胺类抗生素的高效液相色谱
4、-三重四极杆串联 质谱法。 本标准适用于地表水、地下水、海水、工业废水和生活污水中 5种磺胺类抗生素的测定。 当样品体积为 100 ml，浓缩定容至 1.0 ml， 进样体积为 10.0 l 时，本方法磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧 啶、 磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲恶唑 的 检出限 分别 为 0.01 g/L 、 0.01 g/L 、 0.01 g/L 、 0.009 g/L 和 0.01 g/L ，测定下限 分别 为 0.04 g/L 、 0.04 g/L 、 0.04 g/L 、 0.036 g/L 和 0.04 g/L ，测定上限均为 100 g/L 。 2 规范性引用文件 下列文件对于
5、本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用 水规格和试验方法 GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导 HJ 91.1 污水监测技术规范（部分代替 HJ/T 91 污水监测技术规范） HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范 HJ/T 164 地下水环境监测技术规范 HJ 442 近岸海域环境监测规范 HJ 493 水质 样品的保存和管理技术规定 3 方法原理 水样经固相萃取后，水中磺胺类抗生素经液相色谱仪分离，用串联质谱 仪在多反应监测 （ M
6、RM） 条 件下测定，根据保留时间和特征离子对定性， 内标法以峰面积（或峰高）定量。 4 干扰和消除 当样品中存在基 质干扰时，可通过优化色谱条件、稀释样品、减少进样体积以及对样品进行预处理 等方式降低或消除。 5 试剂 DB21/T 3286 2020 2 除非另有说明， 分析时均使用符合国家标准的 优级纯 试 剂 ，实验用水 符合 GB/T 6682，一级 。 5.1 甲醇 （ CH3OH） ： 液 相色谱纯。 5.2 甲酸 （ HCOOH）。 5.3 甲酸溶液 ： 1+1000（ V/V）。 量取 1.0 ml甲酸（ 5.2）缓慢加入 1 L实验用水中，混匀。 5.4 标准物质 5.4.
7、1 磺胺嘧啶 、 磺胺甲基嘧啶 、 磺胺二甲嘧啶 、 磺胺 间甲氧 嘧啶 、 磺胺 甲 恶唑 标准物质：纯度 99%。 5.4.2 磺胺甲基嘧 啶 -13C6内标标准物质：纯度 99%。 5.5 标准溶液 5.5.1 磺胺类抗生素 标准贮备 液： =100.0 mg/L。 准确称取适量的每种磺胺类标准物 质（ 5.4.1），用甲醇配成 100.0 mg/L的标准贮备 液， 或直接 购 买有证标准溶液 ，贮备液在 04 冷藏避光保存，可稳定保存 20天，或参照制造商的产品说明保存。 5.5.2 磺胺类抗生素标准使用 液： =1.00 mg/L。 将磺胺类抗生素 标准 贮 备溶液 （ 5.5.1）
8、 用 甲醇 稀释至 1.0 mg/L，现用现配 。 5.5.3 磺胺甲基嘧啶 -13C6标准贮备 液： =100.0 mg/L。 准确称取适量的 磺胺甲基嘧 啶 -13C6标准物质（ 5.4.2），用甲醇（ 5.1）配成 100.0 mg/L的标 准贮备 液， 或直接 购买有证标准溶液 ，贮 备液 在 04 冷藏 避光保存或参照制造 商的产品说明保存 使用 。 5.5.4 磺胺甲基嘧啶 -13C6标准 使用 液： =1.0 mg/L。 将 磺胺甲基嘧啶 -13C6标准 贮 备溶液（ 5.5.3） 用 甲醇 （ 5.1） 稀释至 1.0 mg/L，现用现配 。 5.6 氮气：纯度 99.9%。
9、6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱 /三重四极杆 质谱仪： 高效液相色谱仪 具备梯度洗脱功能；三重四极杆质谱仪 配有电 喷雾离子化源 （ ESI）。 6.2 色谱柱： 填料为 硅胶基质 C18，粒径 1.8 m ，柱长 100 mm，内径 2.1 mm，或其他等效 色谱柱。 6.3 固相萃取装置。 6.4 浓缩装置 ： K-D浓缩器、氮吹仪等性能相当的设备。 6.5 滤膜： 针式 有机 相过滤器， 孔径 0.22 m ，直径 13 mm， 玻 璃纤维、 亲水性聚丙烯、亲水性聚四氟 乙烯（ PTFE） 或其它等效材质。 6.6 固相萃取柱： 填料为二乙烯苯和 N-乙烯基吡咯烷酮共聚物或同等柱效
10、的萃取柱，规格为 6 ml/500 mg。 6.7 棕色 样品瓶 ： 2.0 ml。 6.8 采样瓶： 500 ml棕色玻璃瓶，螺旋盖（具聚四氟乙烯涂层的密 封垫） 。 6.9 微量注 射器： 10 l 、 50 l 、 100 l 、 1 ml。 7 样品 7.1 样品采集与保存 DB21/T 3286 2020 3 按照 GB/T 14581、 HJ 91.1、 HJ/T 91、 HJ/T 164、 HJ 442和 HJ 493的相关规定进行样品的采集 和保 存 。 采集样品时， 向采样瓶（ 6.8）中 加 入 甲酸 （ 5.2） 500 l ，然后采集 样品至满瓶， 拧紧螺旋盖密 封，摇
11、匀 。水样 04 冷藏避光保存， 48 h内完成分析。 7.2 试样制备 活化：用 10 ml甲醇（ 5.1）活化固相萃取柱，保证固相萃取柱柱头浸润。再用 10 ml实验用水活化 固相萃取柱，保证固相萃取柱柱头浸润。 上样：水样上样前放置至室温，准确量取 100 ml水样，水样以 35 ml/min的流速通过固相萃取柱。 淋洗：用 10 ml实验用水淋洗固相萃取柱，将在固相萃取柱上保留较弱的杂质淋洗下来，弃去淋洗 液。 洗脱：用 10 ml甲醇（ 5.1）洗脱富集后的固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脱液。 浓缩：将上述提取溶液浓缩至低于 1.0 ml近干，加 甲酸溶液 （ 5.3） 定容到 1
12、.0 ml，最后加入内标 使用液 10.0 l，经 0.22 m 滤膜（ 6.5）过滤，置于棕色样品瓶（ 6.7）中，待测定。 7.3 空白试样的制备 用实验用水代替样品按照试样制备（ 7.2）相同操作步骤，制备空白试样。 8 分析步骤 8.1 仪器参考条件 8.1.1 液相色谱仪参考条件 流动相：流动相 A为甲醇 （ 5.1），流动相 B为甲酸溶液 （ 5.3）， 线性 梯度洗脱程序见表 1。 柱温： 40 ； 进样体积： 10 l ； 流速： 0.2 ml/min； 表 1 液相色谱流动相线性梯度洗脱程序 时间（ min） 流动相 A（ %） 流动相 B（ %） 0 5 95 0.5 5
13、95 5.0 30 70 7.0 30 70 7.5 90 10 8.5 90 10 9.0 5 95 10.0 5 95 8.1.2 质谱仪参考条件 DB21/T 3286 2020 4 正离子模式 （ ESI+） ； 离子化电压： 3000 V； 离子源温度： 120； 检测方式： MRM，多反应监测条件见表 2。 表 2 目标 化合物 的 多反应监测 条件 目标化合物 检测离子对（ m/z） 驻留时间（ ms） 锥孔电压（ V） 碰撞电压（ V） 磺胺嘧啶 251.092.0* 20 30 30 251.0156.0 15 磺胺甲基嘧啶 265.115 6.1 20 35 28 265.
14、1108.1* 16 磺胺二甲嘧啶 279.19 2.2* 20 30 28 279.118 6.1 15 磺胺间甲氧嘧啶 281.192.1* 20 30 28 281.1156.1 15 磺胺甲恶唑 254.092. 2* 20 30 30 254.0156. 2 20 磺胺甲基嘧啶 -13C6 271.0162.0* 20 35 28 注：带 *的为定量离子对 8.2 校准 8.2.1 校准曲线的建立 取一定量 磺胺类抗生素 标准使 用液 （ 5.5.2）于甲酸（ 5.3）水 溶液中， 制备至少 5个浓度点的标准 系列 ，磺胺类抗生素 的质量浓度分别为 4.0 g/L 、 10.0 g/
15、L 、 20.0 g/L 、 50.0 g/L 和 100 g/L ， 每毫升标准系列溶液中加入 10.0 l 内标使用液（ 5.5.4），贮存在棕色样品瓶（ 6.7） 中。 将标准系列溶液按浓度由低到高的顺序依次进样，以标准系列溶液中 磺胺类抗生素 的质量浓度为横 坐标， 磺胺类抗生素 的峰面积（或峰高）与内标物的峰面积（或峰高）比值和内标物浓度的乘积为纵坐 标，绘制 校 准曲线。 8.2.2 标准样品谱图 磺胺类抗生素 和 内标物 的总离子流图 ， 见图 1。 DB21/T 3286 2020 5 图 1 磺胺类抗生素 和内标物的总离子流图 （注： 1：磺胺嘧啶、 2： 磺胺甲基嘧啶 、
16、3： 磺胺甲基嘧啶 -13C6、 4： 磺胺二甲嘧啶 、 5： 磺胺 间甲氧 嘧 啶 、 6： 磺胺 甲 恶唑 ） 8.3 测定 8.3.1 试样测定 按照与校准曲线的建立（ 8.1）相同的参考条件，进样 10 l ，进行试样（ 7.2）的测定。 注： 若样品中 磺胺类抗生素 浓度过高，超出校准曲线范围，应稀释后测定， 采用甲酸（ 5.3）水溶液进行稀释。 8.3.2 空白试验 按照与校准曲线的建立（ 8.1）相同的参考条件，进样 10 l ，进 行空白试样（ 7.3）的测定。 9 结果计算与表示 9.1 定性分析 按照 表 2中确定的 母离子和子离子 进行检测， 在相同 实验 条件下， 试样
17、 中 磺胺类抗生素 的保留时间 与标准 样品中 磺胺类抗生素 的 保留时间 相对偏差的绝对值应小于 2.5%； 且待测 样品中定性离子的相对丰 度（ Ksam）与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子相对丰度（ Kstd）进行比较，所得偏差在表 3规定的 最大允许偏差范围内， 则可判定 为样品中存在 磺胺类抗生素 。 Ksam= 1 2AA 100% .（ 1） 式中： Ksam 样品中 磺胺类抗生素 定性离子的相对丰度， %； A2 样品中 磺胺类抗生素 定性离子的峰面积（或峰高）； DB21/T 3286 2020 6 A1 样品中 磺胺类抗生素 定量离子的峰面积（或峰高）。 Kstd = 1
18、 2 std stdAA 100% .（ 2） 式中： Kstd 标准 样品中 磺胺类抗生素 定性离子的相对丰度， %； Astd2 标准 样品中 磺胺 类抗生素 定性离子的峰面积（或峰高）； Astd1 标准样品中 磺胺类抗生素 酸定量离子的峰面积（或峰高）。 表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 Kstd Ksam相对于 Kstd的最大允许偏差 Kstd 50 20% 20 Kstd 50 25% 10 Kstd 20 30% Kstd 10 50% 9.2 定量分析 当 磺胺类抗生素 采用标准曲线 法 进行定量时，样品中 磺胺类抗生素 的质量浓度 x按公式（ 3）计算： DV V
19、ix 1 .（ 3） 式中： x 样品中 磺胺类抗生素 的质量浓度， g/L； 1 计算磺胺类抗生素 的峰面积（或峰高）与内标物的峰面积（或峰高）比值和内标物浓度的 乘积 后， 由标准曲线（ 8.2.1）所得试样中 磺胺类抗生素 的质量浓度， g/L； Vi 萃取液浓缩后的体积， ml； V 水样体积， ml； D 样品 稀释倍数 。 9.3 结果表示 当测定结果小于 1 mg/L时，保留至小数点后三位；当测定结果大于或等于 1 mg/L时，保留三位有 效 数字。 10 精密度和准确度 10.1 精密度 3家 实验室分别对磺胺类抗生素的加标浓度为 0.050 g/L 和 0.500 g/L 的
20、地表水、废水和海水进 行了 6次重复测定 。 DB21/T 3286 2020 7 地表水实验室内相对标准偏差分别在 5.9%10%、 4.3%12%之间，实验室间相对标准偏差分别在 1.5%4.2%、 0.6%1.6%之间，重复性限分别在 0.009 g/L0.011 g/L 、 0.065 g/L0.078 g/L 之间，再现性限分别在 0.009 g/L0.012 g/L 、 0.065 g/L0.078 g/L 之间 。 废水实验室内相对标准偏差分别在 5.0%10%、 3.4%8.4%之间，实验室间相对标准偏差分别在 1.3%4.5%、 0.7%2.9%之间，重复性限分别在 0.00
21、9 g/L0.011 g/L 、 0.066 g/L0.077 g/L 之间，再现性限分别在 0.010 g/L0.011 g/L 、 0.066 g/L0.077 g/L 之间 。 海水实验室内相对标准偏差分别在 5.1%10%、 4.3%7.4%之间，实验室间相对标准偏差分别在 0.6%4.1%、 0.3%1.3%之间，重复性限分别在 0.008 g/L0.0010 g/L 、 0.070 g/L0.079 g/L 之间，再现性限分别在 0.008 g/L0.010 g/L 、 0.071 g/L0.079 g/L 之间 ， 具体见附录 A中表 A.1。 10.2 准确度 3家实 验室分别
22、对磺胺类抗生素的加标浓度为 0.050 g/L 和 0.500 g/L 的地表水、废水和 海水进 行了 6次重复测定，其中地表水加标回收率范围在 80.2%87.3%、 86.8%-90.7%之间；废水加标回收率范 围在 79.1%87.9%、 84.1%-93.8%之间；海水加 标回收率范围在 81.8%87.9%、 88.2%-92.1%之间，具体见 附录 A中 表 A.2。 11 质量保证和质量控制 11.1 空白试验 每批样品（ 20个 /批） 至少做一个空白实验， 空白试样 值 低于 方法检出限。 11.2 校准 校准曲线的相关系数 r 0.995，否则应重新绘制校准曲线；每批样品（
23、 20个）应测定一个曲线中 间校核点，其测定结果与校准曲线相应点浓度的相对误差 应在 20%以内 。 11.3 精密度控制 每批样品应至少测定 10%的平行 双样 ，样品数量少于 10个时，应至少测定一个平行双样 ， 平行双样 测定结果的 相对偏差应 在 20%以内 。 11.4 准确度控 制 每批样品应至少测定 5%的基体加标样品， 样品数量少于 20个时，应至少测定一个 基体加标样品， 加 标回收率应在 75%110%之间。 12 废物处理 实验过程中产生的废液和废物应分类收集和保管，委托有资质的单位进行处理。 DB21/T 3286 2020 8 附录 A （资料性附录） 方法的精密度
24、和准确度 三家实验室 分别对 2种不同浓度的样品进行了测定。精密度和准确度结果见表 A.1和表 A.2。 表 A.1 方法的精密度 样品类型 精密度统计结果 化合物名称 加标 浓度 （ g/L） 实验室 内 相对标准偏差 （ %） 实验室 间 相对标准偏差 （ %） 重复性 限 r （ g/L） 再现性限 R（ g/L） 地表水 磺胺嘧啶 0.050 6.510 3.6 0.009 0.009 0.500 4.65.7 0.7 0.065 0.065 磺胺甲基嘧啶 0.050 6.710 3.9 0.010 0.010 0.500 5.77.2 0.8 0.078 0.078 磺胺二甲嘧啶 0
25、.050 7.812 4.2 0.011 0.012 0.500 5.26.3 1.3 0.073 0.073 磺胺对甲氧嘧 啶 0.050 5.99.6 1.5 0.009 0.009 0.500 4.35.8 0.6 0.066 0.066 磺胺甲恶唑 0.050 6.29.8 4.0 0.009 0.010 0.500 5.56.7 1.6 0.074 0.074 废水 磺胺嘧啶 0.050 7.29.5 2.7 0.010 0.010 0.500 3.47.2 2.6 0.076 0.077 磺胺甲基嘧啶 0.050 5.19.6 1.3 0.010 0.010 0.500 3.58.
26、4 2.9 0.077 0.079 磺胺二甲嘧啶 0.050 5.810 3.0 0.010 0.010 0.500 4.27.2 1.7 0.069 0.069 磺胺对甲氧嘧 啶 0.050 5.78.4 4.5 0.009 0.010 0.500 5.06.7 0.7 0.077 0.077 磺胺甲恶唑 0.050 5.09.6 1.8 0.011 0.011 0.500 4.76.2 1.0 0.066 0.066 海水 磺胺嘧啶 0.050 5.19.1 3.7 0.009 0.009 0.500 4.36.8 0.3 0.073 0.073 磺胺甲基嘧啶 0.050 6.48.8 3
27、.6 0.009 0.009 0.500 4.77.4 1.1 0.077 0.077 磺胺二甲嘧啶 0.050 5.29.2 4.1 0.008 0.008 0.500 4.76.4 0.6 0.071 0.071 磺胺对甲氧嘧 啶 0.050 6.78.5 1.6 0.009 0.009 0.500 6.06.7 0.6 0.079 0.079 DB21/T 3286 2020 9 磺胺甲恶唑 0.050 6.010 4.1 0.010 0.010 0.500 4.96.6 1.3 0.070 0.070 表 A.2 方法的准确度 样品类型 准确 度统计结果 化合物名称 实际样品浓度 （
28、g/L ） 加标 浓度 （ g/L） 回收率范围 （ %） 加标回收率最终 值（ %） PSP 2 地表水 磺胺嘧啶 ND 0.050 80.285.6 83.76.0 ND 0.500 87.788.8 88.41.2 磺胺甲 基嘧啶 ND 0.050 80.986.7 84.76.6 ND 0.500 86.888.2 87.71.6 磺胺二甲嘧啶 ND 0.050 80.187.2 83.57.2 ND 0.500 87.689.8 88.92.4 磺胺对甲氧嘧啶 ND 0.050 84.286.6 85.62.6 ND 0.500 88.589.6 88.91.2 磺胺甲恶唑 ND 0
29、.050 81.087.3 84.86.6 ND 0.500 88.090.7 89.03.0 废水 磺胺嘧啶 ND 0.050 84.287.9 85.34.4 ND 0.500 89.193.8 91.14.8 磺胺甲基嘧啶 0.012 0.050 80.184.3 82.54.4 0.012 0.500 84.189.2 87.05.2 磺胺二甲嘧啶 ND 0.050 81.786.8 84.25.2 ND 0.500 86.088.8 87.62.8 磺胺对甲氧嘧啶 ND 0.050 80.687.5 84.97 .6 ND 0.500 88.789.8 89.31.2 磺胺甲恶唑 0
30、.012 0.050 79.183.7 82.05.0 0.012 0.500 86.387.4 87.32.0 海水 磺胺嘧啶 ND 0.050 82.484.7 84.43.8 ND 0.500 88.291.5 89.33.8 磺胺甲基嘧啶 ND 0.050 81.886.7 84.75.2 ND 0.500 88.590.9 89.32.8 磺胺二甲嘧啶 ND 0.050 83.386.8 85.23.6 ND 0.500 89.492.1 90.72.8 磺胺对甲氧嘧啶 ND 0.050 84.786.8 85.72.2 ND 0.500 88.889.7 89.41.0 磺胺甲恶唑 ND 0.050 83.287.9 85.64.8 ND 0.500 89.390.3 90.01.2 DB21/T 3286 2020 10
