1、 ICS 07.100.99 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 20732021 动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌检测 Detection of Listeria monocytogenes in animal padding 2021-01-25发布 2021-02-25实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 20732021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古农业大学、鄂尔多斯
2、市动物疫病预防控制 中心、内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：赵治国、郭晓宇、张晓东、敖威华、王海艳、崔强、陈林军、延涵、靳木子、 李军燕、罗晓平。 DB15/T 20732021 1 动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定定性检测法。 本文件适用于动物垫料中单核细胞增生李斯特氏菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分
3、析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制法指南 第1部分：实验室培养基制法质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制法指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注： 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 冰箱：2 5 。 4.2 恒温培养箱：30 1 ，36 1 。 4.3 均质器。
4、 4.4 振荡器。 4.5 电子天平：感量0.1 g，0.0001 g。 4.6 全自动微生物生化鉴定系统。 4.7 飞行时间质谱仪。 4.8 二级生物安全柜。 4.9 光学显微镜。 4.10 pH 计。 4.11 微量移液器。 DB15/T 20732021 2 4.12 无菌锥形瓶：500 mL，250 mL。 4.13 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 4.14 无菌培养皿：15 mm 90 mm。 4.15 无菌试管：18 mm180 mm。 4.16 无菌量筒：250 mL，1000 mL。 4.17 无菌棉签。 4.1
5、8 无菌镊子。 4.19 无菌剪刀。 4.20 无菌勺。 4.21 无菌玻片。 4.22 无菌接种环。 5 培养基和试剂 5.1 实验用水：符合GB/T 6682的要求。 5.2 含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):见附录A中 A.2。 5.3 Half Fraser肉汤和Fraser肉汤:见附录A中 A.3。 5.4 牛津琼脂: 见附录A中 A.4。 5.5 革兰氏染液:见附录A中 A.5。 5.6 SIM 动力培养基:见附录A中 A.6。 5.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水甲基红(MR)和 V -P试验用:见附录A中 A.7。 5.8 5 %8 %羊血琼脂:见附录A中 A.8。
6、5.9 糖发酵培养基（木糖和鼠李糖）：见附录A中 A.9。 5.10 过氧化氢试剂:见附录A中 A.10。 5.11 无菌生理盐水:见附录A中 A.11。 5.12 李斯特氏菌显色培养基。 5.13 生化鉴定试剂盒。 5.14 革兰氏阳性菌生化鉴定卡。 5.15 飞行时间质谱仪靶板。 5.16 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株ATCC 19111或CMCC 54004，或其他等效标准菌株。 6 检验程序 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。 DB15/T 20732021 3 30 1,24 h2 h 30 1,24 h2 h 36 1,24 h48 h 图1 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序
7、7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后称取25 g颗粒状或粉 末状垫料样品，加入225 mL Half Fraser肉汤，充分振摇或均质1 min2 min，置30 1 培养 样品制备 检样25 g（mL）+ 225 mL Half Fraser肉汤，均质 0.1 mL培养物匀液 + 10 mL Fraser肉汤 李斯特氏菌显色平板 牛津琼脂平板 接种木糖、鼠李糖，36 1 ,2
8、4 h2 h； 并在TSA-YE平板上划线，36 1 ,18 h24 h 鉴 定 木糖-，鼠李糖+ 结果报告 DB15/T 20732021 4 24 h2 h预增菌。 7.1.2.2 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cm5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去 棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小 重复取样14个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25 mL100 mL的无菌稀释液中，充分振摇制成 样品原液（1 mL原液
9、对应的样品面积为1 cm2），取样量见表1。取25 mL样品原液加入225 mL Half Fraser 肉汤，充分振摇或均质1 min2 min，置30 1 培养24 h2 h预增菌。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m 2 取样量 cm 2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.250.5（含） 50 2 0.50.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 二次增菌 轻轻摇动经过培养的样品混合物，移取0.1 mL，转种于10 mL Fraser肉汤，于30 1 培养 24 h2 h。 7.3 分离培养 分别蘸取Fraser肉汤二次增菌液，划线接种于李斯特氏
10、菌显色平板和牛津琼脂（OXA）平板，于36 1 培养 24 h48 h，观察2种平板上生长的菌落。典型菌落在 OXA 琼脂平板上为黑色菌落，周围 有一黑色的环，直径1.5 mm2 mm；在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征，依据产品说明书进行判定。 7.4 初筛 从选择性琼脂平板上挑取35个典型菌落或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管，于36 1 培养24 h2 h，同时在 TSA-YE 平板上划线，于361培养18 h24 h，然后选择木糖阴性、鼠李 糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。 7.5 鉴定 7.5.1 革兰氏染色镜检 李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为0.4 m0.5 m0.5 m2.
11、0 m；用生理盐水制成 菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。 7.5.2 动力试验 DB15/T 20732021 5 挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或 SIM 动力培养基，于25 30 培养 48 h2 h，李 斯特氏菌有动力，在半固体或 SIM 培养基上方呈伞状生长。如伞状生长不明显，可继续培养 5 d，再 观察结果。 7.5.3 溶血试验 用划线接种法或穿刺接种法，将可疑菌落或典型菌落纯培养物接种血琼脂平板，于36 1 培 养24 h48 h，在明亮处观察，单核细胞增生李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血，若结果不明 显，可置4 冰箱24 h48 h再观
12、察。 7.5.4 生化试验 挑取纯培养的菌落进行单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性 反应的菌落继续进行糖发酵试验和 MR -VP试验。具体操作依据生化鉴定试剂盒说明书进行。单核细胞增 生李斯特氏菌的主要生化特征见表2。 表2 单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别 菌种 溶血反应 葡萄糖 麦芽糖 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷 单核细胞增生李斯特氏菌 (L. monocytogenes） / 格氏李斯特氏菌 (L. grayi) / 斯氏李斯特氏菌 (L. seeligeri） / 威氏李斯特氏菌 (L. welshimeri） / V
13、伊氏李斯特氏菌 (L. ivanovii） / 英诺克李斯特氏菌 (L. innocua） / V 注：阳性；阴性；V结果不定。 7.5.5 辅助鉴定 可根据实验室情况，选取纯培养的菌落用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等进行鉴定， 具体操作依据标准GB/T 33682 和设备操作规范进行。 8 结果报告 综合生化鉴定结果、动力试验结果、溶血试验结果和辅助鉴定结果，报告25 g（cm2）动物垫料样 品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。 9 生物安全措施 为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，孕妇不应从事单核细胞增生李斯特 氏菌的培养和检测工作，所有培养物应小心处置
14、，应按照GB 19489 的有关规定执行。 DB15/T 20732021 6 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经121 高压灭菌处理至少30 min后再弃置。 DB15/T 20732021 7 附录A （规范性） 培养基和试剂 A.1 培养基制法及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制法好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 含0.6 %酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE) A.2.1 成分 胰胨 17.0 g 多价胨 3.0 g 酵母膏 6.0 g 氯化钠 5.0 g 磷
15、酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，煮沸溶解，调节pH至7.20.2，高压灭菌121 ，15 min，倒 板备用。 A.3 Half Fraser肉汤和Fraser肉汤 A.3.1 基础培养基 A.3.1.1 成分 肉胨 5.0 g 胰化蛋白胨 5.0 g 牛肉浸膏 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 氯化钠 20.0 g 磷酸氢二钠 12.0 g 磷酸二氢钾 1.35 g 七叶苷 1.0 g 蒸馏水 1000 mL A.3.1.2 制法 将上述各成分溶于水后加热溶解，调节pH至7.20.2，分
16、装后于121 灭菌15 min，备用。 A.3.2 氯化锂溶液 A.3.2.1 成分 DB15/T 20732021 8 氯化锂 3.0 g 蒸馏水 10 mL A.3.2.2 制法 将氯化锂溶解于蒸馏水中，过滤除菌。 A.3.3 萘啶酮酸钠盐溶液 A.3.3.1 成分 萘啶酮酸钠盐 0.1 g 0.05 M氢氧化钠溶液 10 mL A.3.3.2 制法 将萘啶酮酸钠盐溶解于氢氧化钠溶液中，过滤除菌。 A.3.4 盐酸吖啶黄素溶液 A.3.4.1 成分 盐酸吖啶黄素 0.25 g 蒸馏水 100 mL A.3.4.2 制法 将盐酸吖啶黄素溶解于蒸馏水中，过滤除菌。 A.3.5 柠檬酸铁铵溶液
17、A.3.5.1 成分 柠檬酸铁铵 5.0 g 蒸馏水 100 mL A.3.5.2 制法 将柠檬酸铁铵溶解于蒸馏水中，过滤除菌。 A.3.6 Half Fraser肉汤 A.3.6.1 成分 基础培养基（A.3.1） 100 mL 氯化锂溶液（A.3.2） 1.0 mL 萘啶酮酸钠盐溶液（A.3.3） 0.1 mL 盐酸吖啶黄素溶液（A.3.4） 0.5 mL 柠檬酸铁铵溶液（A.3.5） 1.0 mL A.3.6.2 制法 临用前，按照需用量将A.3.2A.3.5四种溶液加入到A.3.1溶液中。 A.3.7 Fraser肉汤 DB15/T 20732021 9 A.3.7.1 成分 基础（A
18、.3.1） 100 mL 氯化锂溶液（A.3.2） 1.0 mL 萘啶酮酸钠盐溶液（A.3.3） 0.2 mL 盐酸吖啶黄素溶液（A.3.4） 1.0 mL 柠檬酸铁铵溶液（A.3.5） 1.0 mL A.3.7.2 制法 临用前，按照需用量将A.3.2A.3.5四种溶液加入到A.3.1溶液中，混匀后每试管分装10 mL备用。 A.4 牛津琼脂（OXA） A.4.1 基础培养基 A.4.1.1 成分 哥伦比亚琼脂 39.0 g 七叶苷 1.0 g 柠檬酸铁铵 0.5 g 氯化锂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL 示胨 23.0 g 淀粉 1.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂（所用的量根据琼
19、脂的凝胶强度来定） 9.0 g15.0 g A.4.1.2 制法 将上述各成分溶于水后煮沸溶解，调节pH至7.20.2，分装后于121 灭菌15 min，备用。 A.4.2 用于1000mL培养基的添加剂 A.4.2.1 成分 放线菌酮 400 mg 硫酸粘菌素 20 mg 吖啶黄素 5.0 mg 头孢替坦钠 2.0 mg 磷霉素 10 mg 乙醇 5.0 mL 蒸馏水 5.0 mL A.4.2.2 制法 将上述各成分溶解于乙醇/水溶液中，过滤除菌。 A.5 革兰氏染液 A.5.1 结晶紫染液 DB15/T 20732021 10 A.5.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95 %乙醇 20
20、mL 1 %草酸铵水溶液 80 mL A.5.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.5.2 革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.5.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。 A.5.3 沙黄复染液 A.5.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95 %乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.5.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.5.4 革兰氏染色法 A.5.4.1 涂片用火焰固定后滴加结晶紫染液，作用1 min，水洗。
21、A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。 A.5.4.3 滴加95 % 乙醇脱色，约15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 A.5.4.4 滴加复染液，复染30 s1 min，水洗、待干、镜检。 A.6 SIM 动力培养基 A.6.1 成分 胰胨 20.0 g 多价胨 6.0 g 硫酸铁铵 0.2 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼脂 3.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.6.2 制法 DB15/T 20732021 11 将上述各成分加热混匀，调节pH至7.20.2，分装小试管，121 高压灭菌15 min，备用。 A.6.3 试验方法 挑取纯培养的单个可疑菌
22、落穿刺接种到SIM 培养基中，于25 30 培养48 h，观察结果。 A.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用) A.7.1 成分 多价胨 7.0 g 葡萄糖 5.0 g 磷酸氢二钾 5.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.7.2 制法 溶化后调节pH 至7.00.2，分装试管，每管1 mL，121 高压灭菌15 min，备用。 A.7.3 甲基红(MR)试验 A.7.3.1 成分 甲基红 10 mg 95 %乙醇 30 mL 蒸馏水 20 mL A.7.3.2 制法 将10 mg甲基红溶于30 mL 95 %乙醇中，加入 20 mL蒸馏水，混匀。 A.7.3.3 试验方法 取适量琼脂培
23、养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中，36 1 培养2 d5 d。滴加甲基红试剂一 滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。 A.7.4 V-P试验 A.7.4.1 6% -萘酚-乙醇溶液 成分及制法: 取-萘酚6.0 g，加无水乙醇溶解，定容至100 mL。 A.7.4.2 40%氢氧化钾溶液 成分及制法: 取氢氧化钾40 g，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。 A.7.4.3 试验方法 取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水中，36 1 培养2 d4 d。加入6 % -萘酚- 乙醇溶液0.5 mL 和40 % 氢氧化钾溶液0.2 mL,充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内 出现
24、红色，如为阴性，应放在36 1 继续培养1 h 再进行观察。 DB15/T 20732021 12 A.8 血琼脂 A.8.1 成分 蛋白胨 1.0 g 牛肉膏 0.3 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 1.5 g 蒸馏水 100 mL 脱纤维羊血 5 mL8 mL A.8.2 制法 除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121 高压灭菌15 min，冷到50 ，以无菌操作加 入 新鲜脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。 A.9 糖发酵培养基（木糖和鼠李糖） A.9.1 基础培养基 A.9.1.1 成分 胰蛋白胨 10.0 g 牛肉浸糕 1.0 g 氯化钠 5.0 g 溴甲酚紫 0.02 g 蒸馏水 1
25、000 mL A.9.1.2 制法 将上述各成分溶于水后加热溶解，调节pH值6.80.2，分装试管后于121 灭菌15 min，备用。 A.9.2 糖溶液 A.9.2.1 成分 糖（L-鼠李糖或D-木糖） 5.0 g 蒸馏水 100 mL A.9.2.2 制法 将糖溶解于蒸馏水中，过滤除菌，备用。 A.10 过氧化氢酶试验 A.10.1 试剂 3 %过氧化氢溶液，临用时配制。 A.10.2 试验方法 用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，置于洁净玻璃平皿内，滴加3 % 过氧化氢溶液2滴，观 察结果。30 s内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。 DB15/T 20732021 13 A.11 无菌生理盐水 A.11.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.11.2 制法 称取8.5 g氯化钠溶于1000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min。
