1、ICS 65.020.20 CCS B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2044 2020 农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程 Technical code of practice for Agrobacterium-mediated Sugarbeet Genetic Transformation 2020-12-24 发布 2020-01-24 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2044 2020 I 前 言 本 文件 按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则 的 规定 起草。 本文件由内
2、蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会 (SAM/TC 20)归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人： 张自强、白晨、李晓东、张惠忠、王良、韩平安、张必周、付增娟、赵尚敏、 鄂圆圆、郑文哲、张辉。 DB15/T 2044 2020 1 农杆菌介导甜菜遗传转化技术规程 1 范围 本文件确立了培养基、灭菌、无菌苗培养、侵染液制备与叶片 -叶柄预培养、遗传转化、生根培养、 移栽和目的基因检测等技术要求。 本文件适用于农杆菌介导甜菜遗传转化技术操作的全过程。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文
3、件。 3.1 种球 bulb 甜菜的果实。 3.2 植物遗传转化 plant genetic transformation 将外源基因转移 到植物体内并稳定整合、表达和遗传，从而使受体植物体现转移基因的特征的过程。 3.3 农杆菌侵染 infection 农杆菌侵入并感染甜菜外植体的过程。 3.4 叶片 -叶柄 leaf-petiole 甜菜无菌苗叶片和叶柄相连接的部位，长约 1 cm。 4 培养基 4.1 琼脂粉培养基 用于甜菜种球的萌发。成分为（ 1 L）：琼脂粉 7.5 g， pH=5.8。 DB15/T 2044 2020 2 4.2 诱导分化培养基 用于甜菜无菌苗诱导分化培养和甜菜叶
4、片 -叶柄的预培养。成分为（ 1 L）： MS培养基 4.74 g，蔗糖 30 g， NAA（萘乙酸） 0.7 mg， KT（激动素） 1.2 mg，琼脂粉 7 g， pH=5.8。 4.3 生根培养基 用于甜菜无菌苗的生根培养。成分为（ 1 L）： MS培养基 4.74 g， 蔗糖 30 g， NAA 1.2 mg， 琼脂粉 7.5 g，草甘膦 0.08 M， pH=5.8。 4.4 YEP 培养基 用于工程农杆菌的增值培养。成分为（ 1 L）：牛肉浸膏 5 g，酵母提取物 10 g，氯化钠 5 g，琼脂 粉 15 g， rif（利福平） 50 mg， kan（卡娜霉素） 50 mg， pH
5、=7.0。 4.5 侵染液培养基 用于加入农杆菌菌液配制侵染液。成分为（ 1 L）： MS 培养基 4.74 g，蔗糖 30 g， NAA 0.7 mg， KT 1.2 mg， AS(乙酰丁香酮 )150 M， pH=6.8。 4.6 共培养培养基 . 用于侵染后甜菜叶片 -叶柄与农杆菌的共培养。成分为（ 1 L）： MS培养基 4.74 g，蔗糖 30 g，琼脂 粉 7.5 g， AS 150 M， NAA 0.7 mg， KT 1.2 mg， pH=5.8。 4.7 脱菌培养基 用于共培养后的脱菌。成分为（ 1 L）： MS培养基 4.74 g，蔗糖 30 g，琼脂粉 7.5 g， cef
6、（头孢霉 素） 500 mg， kan 50 mg， pH=5.8。 4.8 筛选培养基 用于甜菜转化后的筛选培养。成 分为（ 1 L）： MS培养基 4.74 g，蔗糖 30 g，琼脂粉 7.5 g，草甘膦 0.08 M， pH=5.8。 5 灭菌 5.1 灭菌前准备 制备 75 %酒精、 0.1 %升汞、无菌水。 5.2 种球灭菌 将甜菜种球 磨光 ，用百菌清 （烟剂型） 密闭熏蒸 24 h后，在超净工作台中移至灭过菌的三角瓶中， 随后用 75 %酒精消毒 2 min， 无 菌水漂洗 3 次，接着用 0.1 %的升汞处理 20 min， 无 菌水漂洗 3 次，最后 将消毒后的种子接种于 琼
7、脂粉 培养基上 ，每三角瓶（ 100 ml） 25粒。 6 无菌苗培养 6.1 种球萌发 DB15/T 2044 2020 3 将接种后的培养瓶 置于组培室， 23 条件下进行 培养 ， 7 d 10 d即可萌发。待芽长 2.0 cm 2.5 cm 左右时，带子叶一起切下，接种到新的继代培养基中。培养环境： 温度 23 ，光照强度 3000 Lux，光 照时间 14 h。培养 20 d 25 d成苗 。 6.2 诱导分化培养 在超净工作台上，将无菌苗置于无菌培养皿中，用灭菌后的手术刀将无菌苗的 叶片 -叶柄 切下，长 度为 0.8 cm 1.2 cm的小段，随后将 叶片 -叶柄接种于 诱导 分
8、化培养基中进行分化诱导培养 。培养环境： 温度 23 ，光照强度 3000 Lux，光照时长为 14 h。培养时间 2 d 6 d。 7 侵染液制备与叶片 -叶柄预培养 7.1 菌液活化 超低温冰箱中取出冷冻含有目的基因的农杆菌 EHA105 C58（ rif R） Ti pEHA105（ pTiBo542DT-DNA） （ strep R） Succinamopne） 菌液，将菌液在 YEP培养平板中划线培养，培养温度 28 ，培养 时间 14 h。 7.2 制备侵染液 将培养好的农杆菌取单菌落并扩繁，收集扩繁后菌体并放置侵染液培养基中重新悬浮，使其 OD600 值在 0.30 0.50之间
9、，然后冰浴 1 h，备用。 8 遗传转化 8.1 叶片 -叶柄预处理 诱导分化培养后的叶片 -叶柄，沿其茎走向 用手术刀划出伤口，伤口的深度以不切透叶片 -叶柄为准。 8.2 农杆菌侵染 将预处理后的叶片 -叶柄放入侵染液中， 使用真空泵抽真空，使叶片 -叶柄完全浸入侵染液 ，侵染 20 min 30 min。 8.3 共培养 从侵染液中取出叶片 -叶柄， 置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液， 放入共培养培养基中，进行 共培养。培养环境： 温度 23 ， 暗培养。 培养时间 3 d 6 d。 8.4 脱菌培养 共培养后，将叶片 -叶柄放入脱菌培养基中，进行脱菌。培养环境：摇床转速 125 rp
10、m，温度 25 ， 光 照强度 3000 Lux，光照时间 14 h。脱菌 2 d 3 d。 8.5 筛选培养 脱菌培养后，从脱菌培养基中取出叶片 -叶柄，放入筛选培养基中，置于培养室培养。培养环境： 温度 25 ，光 照强度 3000 Lux，光照时间 14 h。培养 15 d 20 d，进一步培养成转基因甜菜无菌苗。 9 生根培养 DB15/T 2044 2020 4 从筛选培养基中取出抗性芽，切成 1 cm 2 cm的单芽，接种到生根培养基中，培养环境：温度 25 ， 光 照强度 3000 Lux，光照时间 14 h。 20 d 30 d即可诱导出新生根。 10 移栽 10.1 炼苗 去
11、掉封口膜，在组培室锻炼 2 d 3 d。 10.2 室内移栽 选择根系生长健壮的组培苗从三角瓶中移出， 用自来水浸泡根部 12 h，洗净根部残留培养基，移栽 到花盆中（育苗土由蛭石和田园土构成，二者比例为 1:1），并遮阳，定期浇水，室内培养 7 d 14 d。 10.3 大田移栽 待盆栽幼苗生长至 4-6 片真叶时，平均气温稳定在 10 以上时，选择早上或者傍晚移入大田。 11 目的基因检测 11.1 PCR 扩增检测 在组培苗进行筛选培养期间，提取组培苗基因组 DNA，对目的基因进行 PCR扩增，扩增结果有目的基 因条带的说明目的基因转入组培苗并成功表达，没有目的基因条带的说明目的基因没有转入组培苗。 11.2 涂抹草甘膦检测 使用浓度为 1.4 ml/L（大 田除草使用浓度）的草甘膦溶液涂抹甜菜叶片， 10 d后对照非转基因甜 菜的老叶出现退绿、新叶萎缩畸形等药害反应。而转基因甜菜植株仅有个别新生叶片出现轻度萎缩的轻 微药害，但仍保持正常生长活性。说明目的基因转入甜菜再生植株并成功表达。
