1、ICS 65.020.30 CCS B 44 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB 15/T 2033 2020 乳酸菌胞外多糖的分离纯化 与鉴定技术规程 The technical specification for separation, purification and identification of lactobacillus extracellular polysaccharides 2020-11-30 发布 2020-12-30 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 2033 2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化
2、工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则 的规定 起草。 本 文件 由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。 本文件主要起草人： 杜瑞平、王潇、高民、修磊、盛守新、张昊池、潘娜、马燕芬、羿静。 DB15/T 2033 2020 1 乳酸菌胞外多糖的分离纯化 与鉴定技术规程 1 范围 本 文件 规定了 乳酸菌 胞外多糖的 提取、分离、纯 化与鉴定的 方法 与技术流程 。 本文件适用于乳酸菌胞外多糖的提取、分离、纯化及鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文
3、中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 32198 红外光谱定量分析技术通则 GB/T 36240 离子色谱仪 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria(LAB) 一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸 、无 芽孢、革兰氏染色细菌的总称。 3.2 乳酸菌胞外多糖 lactic acid bacteria exopolysaccharide(LAB EPS） 乳酸菌 在生长代谢过程中合成并 分泌于细
4、胞外或渗入培养基中的 多糖及其混合物。 3.3 硫酸 -苯酚法 sulfuric acid-phenol method 利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合 物，再以 比色法 测定。 3.4 离子交换 层析 ion-exchange chromatography(IEC) 在一定 pH 条件下， 根据 被分离样品所带电荷不同而进行的分离方法。 可根据样品性质来选择合适 的离子交换介质。 3.5 凝胶 层析 gel filtration chromatography DB15/T 2033 2020 2 按照 样品 分子量大小进行分离的技术，又称
5、 凝胶过滤 、 分子筛层析 或排阻层析。 通常使用 Superdex、 Surperose、 Sephacryl、 Sepharose、 Sephadex等凝胶纯化介质。 3.6 紫外光谱 ultraviolet and visible spectrum(UV) 测定物质分子在紫外光区 吸收光谱 的分析方法。一般的紫外 光谱 是指近紫外区 （ 200 nm 380 nm） 的 吸收光谱 。 3.7 红外光谱 infrared spectroscopy(IR） 分子能选择性吸收某些波长的红外线 ， 检测红外线被吸收的情况可得到物 质的红外吸收光谱，又称 分子振动光谱或振转光谱。通常所说的红外光谱
6、即指中红外光谱 （ 2.5 m 25 m） 。 3.8 离子色谱 ion chromatography 高效 液相色谱 (HPLC)的一种，是利用被测物质的离子性分离和检测 阴 离子 和 阳离子 的一种液相色谱 方法。 4 材料、仪器和试剂 4.1 菌株材料 分离、保存并鉴定 的 乳酸菌菌 株。 4.2 仪器 数显电热水浴锅 ， 高压蒸汽灭菌锅 ，生化 培养箱 ， 超高速低温离心机 ， 真空低温冷冻干燥机 ，荧光 倒置显微镜，高效液相色谱仪，蛋白核酸纯化系统，离子色谱仪，红外光谱仪，多角度激光检测器。 4.3 试剂与耗材 4.3.1 试剂 MRS固体培养基， MRS液体培养基 , 无水乙醇、三
7、氯乙酸、三羟甲基氨基甲烷、氢氧化钠、葡萄糖、 浓硫酸、浓盐酸、冰醋酸 、 无水乙酸钠、氯化钠等均为分析纯。 4.3.2 耗材 DEAE Sepharose Fast Flow， Sepharose CL-6B， Column XK26/40、 Column XK16/100层析柱 ，透析 袋（截留量 8 K 12 K Da）。 4.3.3 多糖标准品 葡萄糖胺，阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖，葡萄糖醛酸。 DB15/T 2033 2020 3 5 测定步骤 5.1 乳酸菌粗多糖的提取 5.1.1 活化培养 MRS固体 培养基活化乳酸菌，挑取单菌落至 MRS液体培养基中，厌氧条件下， 37 培
8、养 20 h。按 4 % （ v/v）接种量接种到适量 MRS液体培养基中，厌氧条件下 37 培养 30 h。将发酵后的菌液 5000 rpm、 4 条件下离心 15 min，弃去沉淀，收集上清。 5.1.2 三氯乙酸处理 上清液中缓慢加入浓度为 800 mg/mL三氯乙酸，使其终浓度为 40 mg/mL， 4 静置 8 h后 10000 rpm、 4 条件下离心 10 min，弃去沉淀，收集上清。 5.1.3 无水乙醇处理 按 1:4的体积比向上清液中加入无水乙醇， 4 过夜， 10000 rpm、 4 条件下离心 10 min后收集底 部沉淀。将沉淀溶于 60 蒸馏水 中， 10000 r
9、pm离心 10 min，弃去底部不溶沉淀，收集上清。 5.1.4 透析 将上清液装入截留分子量为 8 K Da的透析袋内，透析 2 h 4 h后，更换透析液，之后每 6 h 8 h 更换一次透析液，连续透析 2 d。收集透析袋内多糖溶液，真空冷冻干燥制得乳酸菌粗 多糖 。 5.2 粗多糖纯化 5.2.1 离子交换纯化 5.2.1.1 层析柱处理 将 DEAE-Sepharose Fast Flow填料 装填于 Column XK 26/40（内径： 26 mm，高度 400 mm）层析柱中， 体积为 150 mL， 用 Tris-HCl溶液（ 55 mM， pH 7.5 7.8） 以 1.5
10、mL/min流速过夜 平衡层析柱。 5.2.1.2 纯化 将粗多糖溶于 Tris-HCl中，配成浓度为 10 mg/mL溶液， 0.22 m滤膜过滤后上样。流动相使用 Tris-HCl和含 1 M NaCl的 Tris-HCl洗脱液， 将蛋白质核酸纯化系统 的流速 设置 为 2.0 mL/min，每 3 min 收集 一次洗脱液至试管中 。 5.2.1.3 洗脱曲线绘制 用硫酸 -苯酚法 测定洗脱液中多糖含量， 在 490 nm处 检测 吸光值 ，绘制洗脱曲线。 5.2.2 分子筛纯化 5.2.2.1 层析柱处理 DB15/T 2033 2020 4 将 Sepharose CL-6B装填于
11、Column XK 16/100（内径： 16 mm，高度 1000 mm）层析柱中， 体积为 150 mL，用 Tris-HCl溶液（ 55 mM， pH 7.5 7.8） 以 0.5 mL/min流速过夜 平衡层析柱。 5.2.2.2 纯化 将上一步纯化收集得到的最大组分溶于 Tris-HCl中，配成浓度为 5 mg/mL溶液， 0.22 m滤膜过滤 后上样。流动相使用 Tris-HCl洗脱液，流速为 0.5 mL/min，每 10 min收集 一次洗脱液至试管中 。 5.2.2.3 洗脱曲线绘制 用硫酸 -苯酚法 测定洗脱液中多糖含量， 在 490 nm处 检测 吸光值 ，绘制洗脱曲线。
12、 5.3 EPS 鉴定 5.3.1 紫外光谱扫描 检测纯化 后的多糖是否含有 核酸和蛋白质这两类杂质 。用去离子水将以上获得的纯 EPS溶解，浓度 为 0.5 mg/mL，用 0.22 m滤膜过滤后在 185 nm 540 nm波长范围内进行紫外扫描。 样品流速为 0.5 mL/min。流动相为去离子水。 5.3.2 红外光谱分析 检测多糖化合物特有的结构基团。取干燥的 1 mg 2 mg EPS和 100 mg 200 mg溴化钾粉末混匀后进 行压片，厚度约 0.1 mm。红外光谱仪对样品进行红外扫描，按照 GB/T 32198执行 。 5.4 EPS 分子量测定 5.4.1 色谱条件 色谱
13、柱： TSK Gel G4000PWxl； 流动相： 0.1 M NaCl溶液 ； 流速： 0.5 mL/min； 进样量： 200 L。 5.4.2 分子量的测定 称取 EPS样品适量，溶于 0.1 M NaCl溶液 中，配成浓度为 1 mg/mL溶液，按 5.4.1所述条件上样。使 用 Astra数据分析软件计算样品的分子量。 5.5 EPS 单糖组成测定 5.5.1 色谱条件 色谱柱：分析柱： Carbo PacTMPA20 3150 mm Analytical ； 淋洗液： 250 mM NaOH和 1 M NaAC； 流速： 0.5 mL/min； DB15/T 2033 2020
14、5 进样体积： 10 L； 柱 温： 35 ； 检测器：脉冲安培检测器，金电极。 5.5.2 梯度洗脱条件 A为水， B为 250 mM NaOH， C为 1 M NaAC； 0 min 20 min： 94% A， 6% B， 0% C； 20 min 20.1 min： 89% A， 6% B， 5% C； 20.1 min 35 min： 74% A， 6% B， 20% C； 35.1 min 45 min： 20% A， 80% B； 45.1 min 55 min： 94% A， 6% B。 5.5.3 单糖组成测定 称取 EPS 10 mg于水解 瓶 中，加入 4 M的三 氯 乙酸 4 mL， 充 N2 1 min排出管内空气，旋紧螺旋盖，于 120 水解 2 h， 0.22 m滤膜过滤 后按 5.5.1所述条件 进样。 根据对比保留时间 RT确定 EPS中的单糖组 成 ，并符合 GB/T 36240的要求 。
