1、 ICS 65.202.30 B 45 DB12 天津市 地方标准 DB12/T 952 2020 猪粪中 抗生素残留量检测方法 液相色谱 -质谱 /质谱法 The determination method of antibiotic residues in pig manure by liquid chromatography-mass spectrometry 2020 - 08 - 18发布 2020 - 10 - 01实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 952 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出
2、并归口。 本标准起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、天津 农学院。 本标准主要起草人： 支苏丽 、张克强、 周婧 、 刘海学 、 吴惠惠 、 杜连柱 、 阮蓉。 DB12/T 952 2020 1 猪粪中抗生素残留量检测方法 液相色谱 -质谱 /质谱法 1 范围 本标准规定了 猪粪中抗生素检测的原理、试剂 耗材、仪器 设备、 试样制备 、检测步骤、结果计算 和 精密度。 本标准适用于 生猪养殖场畜舍内以及堆粪场粪便中土霉素、强力霉素、四环素、去甲基金霉素、磺 胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、洛美沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙 星、氟罗沙星、奥比沙星、氟甲喹、西诺沙星
3、 和 依诺沙星残留量的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 1896-2010 兽药残留实验室质量控制规范 3 原理 样品中抗生素残留物用甲醇 -乙腈 -柠檬酸缓冲溶液提取，用固相萃取小柱净化，用液相色谱 -质谱 / 质谱测定，外标法定量。 4 试剂 材料 4.1 水： GB/T 6682 规定的一级水。 4.2 乙腈：色谱级。 4.3 甲醇：色谱级。 4.4 甲酸：色谱级。 4.5
4、EDTA-McIlvaine 缓冲液：称取柠檬酸 12.9 g，磷酸氢二钠 5.45 g，乙二胺四乙酸二钠 37.2 g， 溶于水中，并稀释至 1 L。 4.6 0.1%甲酸溶液：取甲酸（ 4.4） 0.5 mL 溶于水稀释至 500 mL，当天配制。 4.7 标准储备溶液：分别称取适量标准品（精确到 0.00001 g），分别用甲醇（ 4.3）溶解，配制成 100 mg/L，置于冰箱 -20 保存，保质期 6 个月。 4.8 标准工作溶液：准确称取抗生素标准储备液（ 4.7）适量，用甲醇水（ v/v=50:50）配制成不同浓 度系列的混合标准工作溶液（用时现配）。 4.9 Oasis HLB
5、 固相萃取小柱或者相当： 6 mL， 500 mg。 4.10 滤膜： 0.22 m，有机系 。 5 仪器 设备 DB12/T 952 2020 2 5.1 液相色谱 -串联质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ ESI 源）。 5.2 分析天平：感量 0.00001 g 和 0.01 g。 5.3 旋涡混匀 器。 5.4 超声波发生器。 5.5 离心机：最大转速不低于 5000 r/min。 5.6 移液器。 5.7 固相萃取装置。 5.8 氮气吹干仪。 5.9 冷冻干燥器。 6 试样制备 取适量样品，将充分的样品进行冷冻干燥并粉碎，粉碎后装入洁净容器，并于 -18 避光干燥保存。 7 检测步骤 7
6、.1 提取 称取 1.00 g（精确到 0.01 g）干燥猪粪样于 50 mL离心管中，加入 10 mL 乙腈 -甲醇 - EDTA-McIlvaine 缓冲液（ 1:1:2， v/v/v）混合液，涡旋 1.0 min， 100 Hz超声 15 min， 4 离心（ 10000 r/min） 15 min， 将上清液吸取到烧杯中，再重复提取一次，将上清液合并，进行适当稀释至有机相低于 10%。 7.2 净化 首先用 6 mL甲醇和 6 mL水，依次活化固相萃取柱，将稀释过的上清液混匀，以大约 1 mL/min的速度 通过活化后的 HLB固相萃取柱，待过完柱子后，用 6 mL水淋洗，真空抽干柱子
7、，用 6 mL甲醇洗脱柱子（速 度控制在 1 mL/min左右）。将洗脱液于低于 40 下氮气吹干，用 1.0 mL甲醇 :水（ 1:1， v/v， 水 含 0.1% 甲酸）复溶， 0.22 m有机滤膜过滤，用液相色谱 -质谱 /质谱仪测定。 7.3 标准曲线绘制 在仪器的最佳条件下，经过上述优化的前处理方法提取得到空白粪样溶液，分别用甲醇 :水 =1:1溶 液稀释标准混合工作液，配制 0、 5、 10、 50、 100、 200、 500、 1000 g/L系列标准工作溶液，供液相色 谱 -串联质谱测定。分别以目标抗生素定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐 标，绘制标准曲
8、线。 7.4 测定 7.4.1 液相色谱参考条件 7.4.1.1 色谱柱： C18 柱，柱长 100 mm，内径 2.1 mm，粒度 1.8 m， 或性能相当者。 7.4.1.2 柱温： 40 。 7.4.1.3 流动相： A 组分是一级水（含 0.1%甲酸）； B 组分是乙腈。梯度洗脱程 序见表 1。 7.4.1.4 流速： 0.3 mL/min。 7.4.1.5 进样量： 5 L。 DB12/T 952 2020 3 表 1 梯度洗脱程序 步骤 时间 /min 流速 /（ mL/min） 组分 A/% 组分 B/% 1 1.5 0.3 90 10 2 8 0.3 30 70 3 8.1 0
9、.3 90 10 4 12 0.3 90 10 7.4.2 质谱参考条件 7.4.2.1 离子源：电喷雾离子源（ ESI）。 7.4.2.2 扫描方式：正离子扫描。 7.4.2.3 检测方式：多反应监测（ MRM）。 7.4.2.4 离子源温度： 150 。 7.4.2.5 脱溶剂气温度： 500 。 7.4.2.6 脱溶剂气和锥孔气：氮气。 7.4.2.7 碰撞气：高纯氩气。 7.4.2.8 多反应监测（ MRM）离子对、锥孔电压及碰撞能量 参 见附 录 A。 7.4.3 定性测定 在相同条件下进行样品测定时，如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准溶液相比在 2.5% 的允许偏差之内，并
10、且定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过表 2的 规定，则可判断样品中存在相应的目标化合物。 表 2 定性确认时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50% 20% 50% 10% 20% 10% 允许的相对偏差 20% 25% 30% 50% 7.4.4 定量测定 取试样溶液和标准溶液上机测 定，以色谱峰保留时间和离子对定性，读取试样色谱峰面积，依据标 准曲线计算浓度。用外标法定量。在上述色谱 -质谱条件下，目标抗生素标准溶液特征离子的质量色谱 图参见附录 B。试样溶液与基质匹配标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出 线性范围，应重新试验或将
11、试样溶液和基质匹配标准工作溶液作相应稀释后重新测定。 7.4.5 空白实验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 8 结果计算 按公式（ 1）进行计算目标抗生素的残留量，计算结果需扣除空白值： . (1) DB12/T 952 2020 4 式中： X 试样中抗生素的残留量， g/kg； c 从标准曲线上得到的抗生素残留溶液的浓度， ng/mL； v 样液最终定容体积， mL； m 最终样液代表的试样质量， g； 1000 用于单位换算 的 常数。 9 精密度 在重复性 条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的 15%。本方 法精密度根据 NY/T 1896-201
12、0兽药残留实验室质量控制规范规定的筛选分析方法精密度的性能要求，方 法的批内相对标准偏差 25%，批间相对标准偏差 30%。 DB12/T 952 2020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 目标抗生素 特征离子参考质谱条件 表 A.1 目标抗生素特征离子参考质谱条件 名称 母离子 子离子 锥孔电压 （ V） 碰撞 电压 （ V） 保留时间 （ min） 定量限 ( g/kg) 磺胺类 磺胺嘧啶 sulfadiazine 251.21 92.04/156.02 * 30 26/16 3.16 3.40 磺胺噻唑 sulfathiazole 256.11 156.00 */92.02 28
13、 14/26 3.95 2.87 磺胺甲基嘧啶 sulfamerazine 265.10 91.96 */155.95 34 30/16 4.23 1.25 磺胺多辛 sulfadoxin 311.23 92.02/156.0 * 36 36/18 5.89 3.60 磺胺噁唑 sulfamethoxazole 254.15 92.04 */155.96 32 28/18 6.13 5.13 喹诺酮类 氧氟沙星 ofloxacin 362.30 57.95/261.14 * 42 42/30 4.59 0.47 恩诺沙星 Enrofloxacin 360.3 316.3 */245.2 31
14、19 4.92 1.13 二氟沙星 Difloxacin 400.3 299.21 */58.02 40 30/44 5.27 1.67 氟罗沙星 Fleroxacin 370.23 269.15/58.02 * 62 28/32 4.57 0.25 洛美沙星 Lomefloxacin 352.30 265.19 */44.0 36 20/30 4.81 0.66 依诺沙星 Enoxacin 321.22 205.79 */234.06 38 32/20 4.44 0.65 氟甲喹 Flumequine 262 202 */244 36 32/16 7.39 0.17 西诺沙星 Cinoxac
15、in 263.2 189 */245.1 4 26/14 5.97 0.19 奥比沙星 Orbifloxacin 396.4 295.2/352.1 * 53 33.4/24.8 5.02 0.37 四环素类 土霉素 Oxytetracycline 461.24 426.20 */89.08 30 20/24 4.58 1.48 强力霉素 Doxycycline 445.31 97.96 */154.05 32 44/34 5.74 0.15 去甲基金霉素 Demeclocycline 465.32 154.05 */97.96 36 30/52 5.22 0.29 四环素 Tetracycl
16、ine 445.25 410.18 */153.99 32 20/28 4.83 0.20 注： * 表示 定量离子 DB12/T 952 2020 6 B B 附 录 B （资料性附录） 目标抗生素标准溶液离子色谱图 西诺沙星（ 5.97） 二氟沙星（ 5.27） 恩诺沙星（ 4.92） 氟罗沙星（ 4.57） 氟甲喹（ 7.39） 洛美沙星（ 4.81） 氧氟沙星（ 4.59） 依诺沙星（ 4.44） 奥比沙星（ 5.02） 磺胺多辛（ 5.89） 磺胺甲基嘧啶（ 4.23） 磺胺恶唑（ 6.13） DB12/T 952 2020 7 磺胺噻唑 （ 3.95） 磺胺嘧啶（ 3.16） 去甲基金霉素（ 5.22） 强力霉素（ 5.74） 土霉素（ 4.58） 四环素（ 4.83） 图 B.1 四环素类、磺胺类和喹 诺酮类抗生素在多反应监测模式 100 g/kg添加水平条件下标准溶液 离子色谱图 _
