1、ICS 65.120 B 25 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 946 2020 饲料中氨基酸的测定 离子交换色谱 法 Determination of amino acids in feeds-Ion exchange chromatography 2020 - 06 - 29发布 2020 - 08 - 01实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 946 2020 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：杨鸿雁、梁世岳、李玉鹏、陈龙宾、
2、范寰、乔家运。 DB12/T 946 2020 1 饲料中氨基酸的测定 离子交换色谱 法 1 范围 本标准规定了饲料中氨基酸的离子交换色谱法测定方法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品的采 集与制备、测定步骤和结果计算。 本标准适用于饲料原料、配合饲料及浓缩饲料中氨基酸含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期 的引 用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.
3、1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 3.1 常规酸水解法 饲料中的蛋白质在盐酸的作用下，水解成单一氨基酸，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生 测定。水解中，色氨酸全部被破坏，不能测量，胱氨酸和蛋氨酸部分氧化，不能测准。 3.2 氧化酸解法 将饲 料蛋 白中的含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）用过甲酸氧化，使之转变为对酸稳定的氧化物，再 通过酸水解法释放出来，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生测定。 3.3 碱水解法 饲料中的蛋白质在碱的作用下，水解出色氨酸，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生测定。 4 试剂和材料 4.1 本标准所用试剂和水，在没有注明其
4、它要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682中规定的一级水； 所述溶液如未指明溶剂均系水溶液。试验中所需溶液、制剂及制品，在没有注明其它要求时均按 GB/T 603 的规定制备。 4.2 盐酸：优级纯。 4.3 盐酸溶液（ 6 mol/L）： 量 取 盐 酸 500 mL，用水稀释至 1000 mL，混匀。 4.4 茚三酮溶液：按仪器说明书配制或购买。 4.5 pH 系列缓冲液、再生液：按仪器说明书配制或购买。 DB12/T 946 2020 2 4.6 甲酸：浓度为 88%。 4.7 过甲酸溶液：将 30%过氧化氢与甲酸按体积比 1:9混合，室温放置 1 h，置冰水浴中冷却 30 min,
5、 临用前配制。 4.8 盐酸溶液（ 7.2 mol/L）：取盐酸 600 mL，用水稀释至 1000 mL，混匀。 4.9 氢氧化锂溶液（ 4 mol/L）：称取一水合氢氧化锂 167.8 g，用水溶解并稀释至 1000 mL，混匀。 4.10 柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸三钠 14.71 g、氯 化钠 2.92 g和柠檬酸 10.50 g，溶于 500 mL 水 中， 加入 硫二甘醇 5 mL和辛酸 0.1 mL，定容至 1000 mL。 4.11 氢溴酸（ 48%）：分析纯。 4.12 高纯氮气：纯度为 99.999%。 4.13 氨基酸混合标准储备液：含 L-天门冬氨酸、 L-苏氨酸等 1
6、7种常规水解分析用氨基酸，各组分浓 度均为 2.50 mol/mL。 4.14 磺基丙氨酸 -蛋氨酸砜标准储 备液：准确称取磺基丙氨酸（纯度 99.0%） 105.7 mg和蛋氨酸砜 （纯度 99.0%） 113.3 mg，用水溶解并定容至 250 mL,浓度均为 2.50 mol/mL， 2 8保存 ， 有效 期 1年。 4.15 色氨酸标准储备液：准确称取色氨酸标准品（色谱纯） 127.5 mg，加少许水和数滴 0.1 mol/L 氢氧化钠 溶液 使之溶解，用水定容至 250 ml， 浓度为 2.50 mol/mL， 2 8保存 ， 有效期 1年。 4.16 混合氨基酸标准工作液：准确吸取
7、 氨基酸混合标准储备液、 磺基丙氨酸 -蛋氨酸砜标准储备 液和 色氨酸标准储备液 各 1 mL，置于 25 mL容量瓶， 用柠檬酸钠缓冲液 定容，混匀，各氨基酸组分浓度 均 为 100 nmol/mL， 2 8保存 ， 有效期 3个月。 5 仪器设备 5.1 样品粉碎机。 5.2 样品筛 孔 径 0.18 mm。 5.3 分析天平 感量 0.1 mg。 5.4 恒温鼓风干燥 箱 。 5.5 氮吹仪。 5.6 旋涡混合仪。 5.7 氨基酸分析仪 具有离子交换柱、茚三酮柱后衍生装置及 570 nm 和 440 nm光度检测器。 6 样品的采集与制备 按 GB/T 14699.1采集样品； 按 GB
8、/T 20195制 备样品，要求样品粉碎至过 0.18 mm 孔径（ 80目）样品 筛，充分混合均匀后装入密封袋中备用。 7 测定步骤 7.1 样品的水解 7.1.1 常规酸水解法 称取 试样 30 mg 70 mg（约含蛋白质 5 mg 20 mg，精确至 0.1 mg）于 25 mL水解管中，准确加入 10 mL盐酸溶液，充氮气约 1 min后拧紧瓶盖，将水解管放入 110 1 恒温干燥箱，水解 22 h 24 h。 冷 却至室温，混匀。 DB12/T 946 2020 3 7.1.2 氧化酸解法 称取 试样 50 mg 100 mg（约含蛋白质 7.5 mg 25 mg，精确至 0.1
9、mg）于 25 mL水解管中，冰水浴 冷却 30 min后，加入已冷却的过甲酸溶液 2 mL，待样品湿润（勿摇），拧紧瓶盖，连同冰浴一起置于 0 4冰箱中，反应 16 h，加入 0.3 mL氢溴酸，振摇后放回冰 浴静置 30 min， 取出 放至室 温后，加入 10 mL 盐 酸溶 液，充氮气约 1 min后拧紧瓶盖，将水解管放入 110 1 恒温干燥箱，水解 22 h 24 h。冷却 至室温，用水将内容物转移到 25 mL容量瓶，定容， 混匀 。 7.1.3 碱水解法 称取 试样 50 mg 100 mg（约含蛋白质 7.5 mg 25 mg，精确至 0.1 mg）于 10 mL聚四氟乙烯水
10、解管 中，加入 1.5 mL氢氧化锂溶液，充氮气约 1 min后拧紧瓶盖，放入 110 1 恒温干燥箱，水解 20 h后， 冷却至室温，用水将内容物转移到 25 mL容量瓶中，用盐酸溶液 中和至 pH值 为 6 7，定容， 混匀 。 注： 以上 三种 方法 依所要测定的氨基酸种类选用 。 7.2 上机水解 液的 制备 将上述水解液过滤， 取 0.5 mL滤 液于小试管中，置于氮吹仪， 65吹干，必要时加少许水重复蒸 干 2次 3次。准确加入 2 mL 5 mL柠檬酸钠缓冲液 ，旋涡混合仪混匀， 用 0.22 m水 系过滤器过滤到上 机瓶中，待测。 7.3 测定 按照仪器使用说明书放置茚三酮溶液
11、与 pH系列缓冲液、再生液，设置仪器色谱条件，将混合氨基 酸标准工作液与处理好的样品水解液一同上机测定，仪器自动将试样的各氨基酸色谱峰面积与相应的标 准品峰面积对比，计算分析，得出各氨基酸的含量，见图 1。 图 1 混合氨基酸标准工作液 色谱图 8 结果计算 DB12/T 946 2020 4 8.1 计算方 法 氨基酸含量计算见式（ 1）。 W（ %） = . (1) 式中： W 某氨基酸的含量， %； A 每毫升上机水解液氨基酸的含量， ng； D 稀释倍数； M 试样质量， mg。 8.2 允许差 对于酸解测定的氨基酸，当含量小于或等于 0.5%时，两平行样测定值相对偏差不大于 5%；含量大于 0.5%时，相对偏差不大于 4%。对于色氨酸，当含量小于 0.2%时，两平行样测定值之差不大于 0.03%；含 量大于或等于 0.2%时，相对偏差不大于 5%。 _
