1、ICS 65.020.01 B 16 DB12 天津市 地 方 标 准 DB12/T 1006 2020 茄子黄萎病菌土壤带菌 PCR 检测技术规程 Technical regulation of PCR detection for verticillium dahliae in soil 2020 - 12 - 17 发布 2021 - 01 - 16 实施 天津市市场监督管理委员会 发布 DB12/T 1006 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口 。 本标准起草单位：天津市植物保护研究所。 本标准主要起草人：
2、高苇、王勇、杨利娟、贲海燕、张春祥、刘晓琳、姚玉荣、王万立。 DB12/T 1006 2020 1 茄子黄萎病菌土壤带菌 PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了茄子黄萎病菌的 PCR检测的仪器和试剂、土壤取样、 PCR检测、结果判定、土样及资料 保存。 本标准适用于土壤中茄子黄萎病菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本 文件的应用是必不可少的。凡注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订版）均适用于本文件。 GB/T 6682 分析 实验室用水规格和试验方法 GB/T 36197-2018 土壤质量 土壤采样技术指南 GB
3、/T 36199-2018 土壤质量 土壤采样程序设计指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 茄子黄萎病菌 verticillium wilt of eggplant 茄子黄萎病菌大丽轮枝菌（ Verticillium dahlia Kleb.）可以侵染多种植物引起一种土传的维管 束病害，病菌可在土壤中长期存活，是茄果类作物生产中危害最为严重的土传病害。茄子黄萎病菌的基 本信息参见附录 A。 3.2 微菌核 verticillium wilt of eggplant 茄子黄萎病菌生长过程中，一条或多条菌丝体膨大、细胞壁增厚后，多向芽殖而形成的多细胞结构， 该结构为肉眼可见的
4、黑色菌丝颗粒。 3.3 土壤带菌 soil-borne 土壤中携带能够诱发侵染植株发病的病原菌 。 4 仪器和试剂 4.1 主要仪器 涡旋振荡仪、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、聚合酶链式反应仪（ PCR仪）、水浴锅、电子天平（感 量 0.1 g和 0.1 mg）、电泳仪、凝胶成像仪。 4.2 主要试剂 DB12/T 1006 2020 2 水饱和酚、三氯甲烷、液氮、异丙醇、无水乙醇、 DNA荧光染料（ Gel Red）、 Tris-HCl等。 DNA分 子量标准（ DNA Marker，能够区分 100 bp 1000 bp的 DNA片段）。 十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）抽提液： 2% C
5、TAB， 100 mmol/L Tris Cl（ pH 8.0）， 20 mmol/L EDTA （ pH 8.0）， 1.4 mol/L氯化钠。 PCR反应混合物： 2 Master Mix: Taq DNA聚合酶， 2 PCR反应缓冲液， dNTP混合物等。 10 TAE电泳缓冲液： 242 gTris-base， 57.1 mL冰乙酸， 100 mL 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0）加蒸馏 水至 1000 mL，使用时稀释 10倍。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682要求。 5 待测土壤取样 土壤采样按照 GB/T 36199-2018和 GB
6、/T 36197-2018的有关要求进行，每块栽培地（面积 667m2左右） 按照“ S”采样法设置 15个采样点，使用不锈钢土壤取样器采集 0 40cm耕层土样，将所有采样点土壤混 匀后放入采样袋中。 6 检测与鉴定 6.1 土壤样品预处理 将采集的土壤样品送回实验室后，打开采样袋在室内自然风干（自然风干时间不能超过 24 h）， 然 后采用 2 mm孔径的土壤筛过滤土壤，过滤后的土样进行检测。 6.2 样品总 DNA 的提取 每个样品设置 3个重复 3个平行，每个重复称取 1 g土样，放入灭菌的研钵中，加入液氮充分研磨。 向研钵中加入 4 mL预热的 CTAB抽提液，倒入 15 mL灭菌离
7、心管中，反复震荡混合后， 65水浴 30 min， 4 14 000 g离心 10 min，保留上清液。 取上清液，加入等体积水饱和酚，充分混匀后， 4 14 000 g离心 10 min。 取上清液，加入等体积的三氯甲烷 :异戊醇（ 24:1）， 4 14 000 g离心 10 min。继续三氯甲烷 : 异戊醇（ 24:1）抽提，直至有机相和水相之间无蛋白层为止。 吸取上清，加入 2/3体积预冷的异丙醇混匀， 4 14 000g离心 10 min，可见 DNA沉淀。 弃去上清液， 70冷乙醇，漂洗 DNA沉淀 2次 3次，充分风干后溶解于适量去离子水中。 6.3 PCR 检测 将得到的土壤
8、DNA样品进行 10倍、 100倍和 1000倍梯度稀释，取 DNA原液和稀释后的各梯度 DNA溶液各 1 L，加入到 PCR反应体系中进行扩增反应。同时，设置阴性对照和阳性对照（阴性对照为不含茄子黄 萎病菌 1 g土壤提取的 DNA，阳性对照为含茄子黄萎病菌 1 g土壤提取的 DNA），空白对照为未加入 DNA模 板。具体 PCR检测方法见附录 B。 7 结果判定 7.1 阳性对照经 PCR 扩增反应后出现 334 bp 大小的条带，而阴性对照和空白对照不出现任何条带，试 验结果成立，反之不成立。 DB12/T 1006 2020 3 7.2 在试验结果成立的前提下，土壤样品 DNA 扩增出
9、与阳性对照一致的 334 bp 条带，则说明土壤中存 在茄子黄萎病菌，否则则说明不存在黄萎病菌。 8 土样及资料保存 检 测判定完成后，土壤样品保存方法按照 GB/T 36197-2018有关要求执行。检测判定过程及有关数 据、表格要进行详细记录并归档保存。 DB12/T 1006 2020 4 A A 附 录 A （资料性附录） 茄子黄萎病菌的分类地位、病原特征及发病症状 A.1 病原及其分类地位 茄子黄萎病由大丽轮枝菌（ Verticillium dahliae Kleb.）引起，属于半知菌亚门（ Deutermycotina）， 从梗菌科（ Moniliaceae），轮枝菌属（ Vert
10、icillium）。已报道的茄子黄萎病的病原菌为黑白轮枝菌 （ V.albo-atrum）和大丽轮枝菌（ V.dahliae）。而我国国内对于茄子黄萎病的病原鉴定结果均为大丽 轮枝菌（ V.dahliae）。 A.2 病原特征 茄子黄萎病病原大丽轮枝菌（ V.dahliae），寄主范围广泛，可以危害茄子、棉花、草莓、马铃薯、 辣椒等多 200多种农作物 ， 其形成的微菌核在无寄主的土壤中可存活 10年以上，是主要的初侵染源。 A.3 症状及危害 茄子黄萎病在茄子整个生长期均有发生，在门茄坐果时表现出症状，盛果期最为严重。茄子黄萎病 发病时，下部叶片叶脉间或叶缘产生淡黄色斑点，逐渐发展到半边叶片
11、或整个叶片变黄，发病严重导致 病叶大量脱落。茄子黄萎病多数从一 边开始发病，另外半边正常，俗称“半边疯”。解剖病株可发现根、 茎、分枝以及叶柄等部位维管束变成褐色。茄子黄萎病田间症状如图 A.1所示。 图 A.1 茄子黄萎病田间症状 DB12/T 1006 2020 5 B B 附 录 B （规范性附录） 茄子黄萎病病原 PCR 检测方法 B.1 茄子黄萎病病原特异性引物 Vd-ITS1-45-F： 5 -CCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3 Vd-ITS2-379-R： 5 -ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3 引物序列： Vd-ITS1-45-F： 5 -CCGGTCCA
12、TCAGTCTCTCTG-3 Vd-ITS2-379-R： 5 -ACTCCGATGCGAGCTGTAAC-3 该特异引物扩增序列信息： 1 ccggtccatc agtctctctg tttataccaa cgatacttct gagtgttctt agcgaactat 61 taaaactttt aacaacggat ctcttggctc tagcatcgat gaagaacgca gcgaaacgcg 121 atatgtagtg tgaattgcag aattcaggaa tcatcgaatc tttgaacgca catggcgcct 181 tccagtatcc tgggaggca
13、t gcctgtccga gcgtcgtttc aaccctcgag ccccagtggc 241 ccggtgttgg ggatctacgt ctgtaggccc ttaaaagcag tggcggaccc gcgtggccct 301 tcctatgcgt agtagttaca gctcgcatcg gagt B.2 PCR扩增 按下列组分制备 PCR反应体系 50 L，反应同时阴性对照和空白对照，具体反应体系见表 B.1。将下 列 B.1 PCR反应体系中各组分加入 PCR反应管中， PCR反应程序为： 94 预变性 5 min； 94 变性 1 min， 56 退火 1 min， 72
14、延伸 1 min，共 35个循环； 72 延伸 10 min， 4保存。 表 B.1 PCR 反应体系 反应组成 体积（ L） Eerald Amp Max PCR Master Mix（ 2MasterMix）（ CodeRR320） 25 引物 Vd-ITS1-45-F (10 mol/L) 1 引物 Vd-ITS2-379-R (10 mol/L) 1 模板 DNA 1 RNase free dH2O 22 Total 50 B.3 PCR结果判定 配置 20 g/L质量浓度的琼脂糖凝胶。每 100 mL的琼脂糖凝胶溶液中加入 5 L EB或其他核酸染料， PCR扩增产物电泳后，在凝胶成像系统中检测。观察电泳结果（如图 B.1）， PCR产物在 334 bp处有条带 出现，判断阳性即土样中含有茄子黄萎病菌，否则为阴性。 上游引物 Vd-ITS1-45-F 下 游引物 Vd-ITS1-379-R DB12/T 1006 2020 6 注： M： Marker DNA Ladder; 1, 检测带菌样本 ; 2, 阳性对照 ; 3, 阴性对照 ; 4, 空白对照。 图 B.1 茄子黄萎病病原特异性 PCR 扩增电泳图谱 _
