1、ICS 13.310 A 92 法庭科学 唾液中 吗啡 和 O6-单乙酰 吗啡 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for morphine and 6-acetylmorphine in saliva samples LC-MS GA 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 ICS 13.310 A 92 GA GA/T 中华人民共和国公安部 发布 - -发布 - -实施 GA I 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布
2、机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国 刑事技术 标准化 技术委员会 毒物分析分技术委员会 （ SAC/TC 179/SC 1） 提出并 归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、 山东省分析测试中心 、 山西医科大学 。 本标准主要起草人： 何毅、陈跃、张云峰、崔冠峰、任昕昕、 贠 克明、尉志文、王芳琳、于忠山 GA 1 法庭科学 唾液中吗啡 和 O6-单乙酰吗啡 检 验 液相色谱 -质谱 法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 唾液中 吗啡 和 O6-单乙酰吗啡 的 液相色谱 -质谱 （ LC-MS）定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 唾液中吗啡 和 O6-单乙酰吗啡的
3、定性分析和定量分析。 其他 可疑 样 品中 吗啡 和 O6-单乙酰 吗啡 的定性分析和定量分析 可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定 的术语和定义适用于本文件 。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对唾液样品进行提取、净化及浓缩，采用 液相 色谱 -质谱法 定性 定量，以保留时间、质谱特征离子
4、和离子丰度比作为定性判断依据； 以 峰面积为依据， 采用 外标法或内标法进行定量分析。 5 试剂 和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一 级水。在分析中使用的试剂均为 色谱 纯，试剂包括： a） 乙腈； b） 甲酸； c） 甲醇； d） 氨水 ； e） 标准 溶液： 1) 1.0mg/mL 标准 物质溶 液： 据 吗啡和 O6-单乙酰吗啡 标准物质纯度和盐型换算后 ， 各称取 适量，分别 用甲醇配制 1.0mg/mL 吗啡和 O6-单乙酰吗啡 标准物质溶液，置于冰箱中 冷藏 保存 。 有效期 6 个月 。或采用市售标准溶液； 2) 10.0g /mL 混合标准工
5、作溶液：移取 1.0mg/mL 的 吗啡和 O6-单乙酰吗啡 标准物质溶液各 0.1mL，用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存 。 有效期 3 个月 。 实验 中所用其 他 浓度的混合标准工作溶液均由 10.0g /mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到 。 注 ： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 GA 2 5.2 材料 材料包括 ： a) 唾液采集管； b) 具盖离心管； c) 有机系微孔滤膜： 0.22m。 6 仪器与设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪 ： 配有电喷雾离子源 （ ESI） 和三重四极杆质量分析器 ； b) 电子 天平 ； c) 离心机 ；
6、 d) 振荡 器； e) 移液器 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品制备 7.1.1.1 蛋白沉淀 取唾液检材样品 ，以 8000r/min离心 30min， 取上清液 100L于具盖离心管中， 加入乙腈 400L，振荡 15min， 3000r/min离心 15min， 取上清液，若采用 7.1.2.1 b)流动相 1分析，上清液需置于浓缩器上 50水 浴下空气流吹干，残留物用甲醇 0.5mL溶解，用有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析； 若采用 7.1.2.1 c)流动相 2分析，上清液用有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析 。 7.1.1.2 质
7、控 样品制备 取等 量离心后的空白 唾液样品两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加 吗啡和 O6-单乙 酰吗 啡 标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为 10ng/mL），与检材样品平行操作，得到空白样品 提取液和添加样品提取液供 LC-MS 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 （ 液相色谱 -质谱 ） 以下条件作为参考，可根据不同仪器实际 情况 进行调整： a） 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18柱（ 2.1mm50mm， 1.7m）或等效 色谱柱； 注： ACQUITY UPLC BEH C18柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一
8、信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b） 流动相 1： A： 乙腈， B： 0.1%甲酸水溶液； c） 流动相 2： A： 乙腈， B：氨 水溶液 （ pH 值 9） ； d） 柱温： 35； e） 流速： 0.5mL/min； f） 进样量 ： 5L； g） 洗脱 方式 ：梯度洗脱，梯度见表 1； h） 离子源： 电喷雾电离源 （ ESI） ； i） 检测方式： 正离子 ； GA 3 j） 扫描方式： 多反应离子监测 （ MRM） ； k） 毛细管电压： 3.00kV； l） 离子源温度： 150； m） 脱溶剂气
9、温度： 350 ； n） 脱溶剂气流量： 700L/h； o） 锥孔气流量： 50L/h； p） MS 参考条件 （ 定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量等 ） 见表 2。 表 1 梯度洗脱条件 时间 min A B 0 10% 90% 0.50 30% 70% 1.00 90% 10% 1.50 10% 90% 3.00 10% 90% 表 2 MS 参考条件 名 称 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 吗啡 286.2165.1 286.2165.1 42 40 286.2201.1 28 O6-单乙酰吗啡 328.2165.1 328.2165.1 46
10、34 328.2193.0 28 238.1207.1 14 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品制备 准确 移取 离心后 唾液 样品 100L两 份，按 7.1.1进行操作 。 准确移 取与检材样品等量 离心后的 空白 唾液 样品 三 份 ，一份作为空白样品，另两份均 添加 吗啡和 O6-单乙酰吗啡 标准物质作为添加样品 （添加样品中目标物含量 应为检材样品中目标物含量的 (100 30)%， 混匀 ）， 与检材样品平行操作，得到 空白样品提取液 和添加样品提取液供仪器 分析 。 7
11、.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液， 按 7.1.2.1 的分析条件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 GA 4 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物的保留时间和峰面积值，按公式 (1)计算检材样品 中目标物的含量 ： 添样添 样添样 VMA VMAW = .(1) 式中： W 检材样品 中目标物的含量，单位为微克每毫升（ ng/mL） ； A 样 检材 样品提取液 中目标物
12、峰面积平均值； M 添 添加样品中标准物添加量，单位为微克 （ ng） ； V 样 检材 样品 的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品 的取 样量，单位为毫升 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.2 计算相对相差 记录 两 份平行操作的检材 样品中目标物的 含量，按公式 (2)计算相对相差： %10 0X XXRD 21 = . (2) 式中： RD相对相差 ，用百分比（ %）表示 ； X1、 X2两个检材 样品 平行定量测定的含量数值； X 两个检材 样品 平行定量测定含量的
13、平均值。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳 性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准 溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比，相对偏差不超过表 3 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 表 3 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 20% 50% 10% 20% 10% 最大允许 相对 偏差 20% 25% 30% 50% 吗啡和 O6-单乙酰吗啡 的 保留时间及色谱峰参见附录 A。 本 方法 检测唾液中吗啡和
14、O6-单乙酰吗啡 的 检出限 参见附录 A。 8.1.2 阴 性结果评价 GA 5 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 8.2 定 量 结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠 ， 应按 7.2 重新提取检验。 GA 6 附 录 A (资料性附录 ) 吗啡 和 O6-单乙酰吗啡相关图谱 吗啡 和 O6-单乙酰吗啡相关图谱见图 A.1。 本 方法 检测唾液中吗啡和 O6-单乙酰吗啡的检出限 为 10ng/mL。 图 A.1 吗啡 和 O6-单乙酰吗啡的 LC-MS 谱 图 _
