1、 faICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材 中 红霉素和罗红霉素 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for erythromycin and roxithromycin in biological samples LC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
2、 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC179/SC1） 提出并 归口。 本标准 起草单位：公安部物证鉴定中心 、深圳市公安局。 本标准 主要 起草人： 张云峰 、 王芳琳 、 黄健 、 王炯 、 常靖 、 王瑞花 、 董颖 、 张蕾萍 、 侯小平 、 栾玉 静 、 杜鸿雁 、崔 冠峰 、 于忠山 、 何毅 、李树辉。 GA/T 1 法庭科学 生物 检材 中 红霉素和 罗红霉素 检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物 检材 （血、尿、肝、肾、胃及胃内容等） 中 红霉素和 罗红霉素 的液相色 谱 -质谱（ LC-MS） 定性定量 检验方
3、法。 本标准适用于 法庭科 学 生物检材中 红 霉素和罗红霉素的 定性分析和定量分析。 其他可疑 样 品中 红霉 素和罗红霉素 的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求， 对生物检材进行提取 、 净化 及浓缩 ， 采用
4、 液相 色谱 -质谱法定性定量 ，以保留时间、 质谱 特征离子 和相对丰度 比 作为定性判断依据； 以峰面积为依据， 采用外标法 进行定量分析 。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实 验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一 级水。在分析中使用的试剂均为 色谱纯 ， 试剂包括 ： a) 甲醇； b) 乙腈 ； c) 甲酸； d) 氨水 ； e) 0.1%甲酸的 5mmol/L 甲酸铵 水溶液 ： 称 取 0.315g 甲酸铵 加水溶解，加 1mL 甲酸 ，用水 稀释 至 1000mL； f) 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 （ pH 值 8） ： 称 取磷酸氢二钾 5.59g 与磷酸二氢钾
5、 0.41g，用水 定容 至 1000mL； g) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准 物质溶 液： 根据红霉素和罗红霉素标准物质的纯度， 各称取适量， 分别用 甲醇配制 1.0mg/mL 红霉素和罗红霉素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个 月。或采用市售标准溶液； GA/T 2 2) 10.0g/mL 混合 标准 工作 溶 液 ： 分别 移取 1.0mg/mL 的红霉素和罗红霉素标准物质溶液各 0.1mL，用甲醇 稀释 至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 3 个月。实验 中所用其 他 浓度的混合标准工作 溶 液均由 10.0g/mL 混合标准工作溶液 用
6、甲醇稀释得到 。 注： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料 包括： a) 具盖离心管 ； b) 有机系微孔滤膜： 0.22m； c) 固相萃取柱 ： Oasis HLB 柱或等效固相萃取柱 ，使用前依次用甲醇 、 水活化。 注： Oasis HLB 柱是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 电子天平 ； c) 离心机； d) 振荡器
7、； e) 移液器 。 7 操作 方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 液液萃取 取血液等液体 检材 样品 0.5mL2.0mL， 或称取铰碎的 肝脏等 固体检材样品 0.5g2.0g于 具盖离心管 中 ， 用氨水调 pH值至 9， 加入 4mL乙酸乙酯，振荡 10min， 8000r/min离心 10min， 分离 有机相；重复提取 一次，合并两次提取的有机相，置于浓缩器上 50浓缩至干，残留物用 甲醇 200L溶解 ， 用 有机 系 微孔 滤膜过滤，作为检材样品提取液供 仪器 分析 。 7.1.1.2 固相萃取 取血液等液体 检材 样品 0.5mL2.0mL，或称取
8、铰碎的 肝脏等 固体检材样品 0.5g2.0g于 具盖离心管 中 ， 以 4倍体积 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 稀释 ，振荡 10min， 8000r/min离心 20min，取上清液 转移 至 已活化 好的 HLB固相萃取柱中 ， 控制流速为 2mL/min， 依次 用 3mL水、 3mL甲醇 /水 （体积比 1:9） 溶液淋洗， 弃 去淋洗液 ， 挤干水分或离心或真空抽固相萃取 柱 2min， 用 3mL甲醇洗脱， 收集 洗脱液 并 置于浓缩器上 于 50 浓缩至干 ， 用 初 始流动相 1mL溶解 ， 用 有机 系 微孔滤膜过滤，供 仪器 分析 。 7.1.1.3 质控样品制备 GA/
9、T 3 取 等量相 似 基质的 空白样品 （若 无相似 基质空白 样品可用血液替代） 两 份 于具盖离心管中 ，一份 作 为空白样品 ， 一份添加 红霉素 或 罗红霉素 标准物质，作为添加样品 （ 添加 样品 的 浓度为 2.0ng/mL） ，与 检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析 。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 （ 液相色 谱 -质谱） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3柱 (2.1mm50mm， 1.7m)或等效 色谱 柱 ； 注： ACQUITY UP
10、LC HSS T3是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相： A： 甲醇 ， B： 0.1%甲酸 的 5mmol/L甲酸铵 水 溶液 ； c) 洗脱：梯度洗脱，梯度见表 1 ； 表 1 梯度洗脱条件 时间 min A B - 10% 90% 1.5 40% 60% 1.8 90% 10% 2.2 90% 10% 2.5 10% 90% 4.0 10% 90% d) 柱温： 35 ； e) 进样量： 2L； f) 流速： 0.6mL/min； g) 离子源：电喷雾电离
11、（ ESI）； h) 检测方式：正离子 ； i) 毛细管电压： 3.5kV； j) 源温度： 150 ； k) 雾化气流速： 800L/h； l) 雾化气温度： 450 ； m) 扫描模式：多反应离子监测（ MRM）； n) MS 质谱参考条件 （ 定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量 ） 见表 2。 表 2 MS 参考条件 目标物 定量离 子 对 定性离子 对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 红霉素 734.4 158.1 734.4 158.1 24 30 734.4 576.4 18 罗红霉素 837.6 158.1 837.6 158.1 26 36 837.6 679.5 22 7.1.
12、2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 GA/T 4 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液等液 体检材 样品 1.0mL 2.0mL， 或称取铰碎的 肝脏等 固 体检材 样品 1.0g 2.0g两份 ， 按 7.1.1进行操作。 内标 -工作曲线法： 另取等量相似基质的空白样品六份， 一份作为空白样品，另外五份 添加 不同浓 度的 标准物质 （添加浓度应呈良好的线性关系，且 检材样品中目标物的含量应在线性范围内 ） ，作为添 加样品，与检材样品平行操作。 内标 -单点校正法： 另取等量相似基质的空白样品 两份 ，
13、一份作为空白样品，另外一份 添加标准物 质 （ 检材样品中目标物含量应为添加样品中目标物含量的 （ 10050） %） ，作为添加样品，与检材样品 平行操作。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1规定的 条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液 或基质标准工作溶液 及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条 件每个样品进样分析 2 3 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 外标 -单点法 记录各样品提取液平行进样 2 3 次 的 目标物保留时间和峰
14、面积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品 中目标物的含量，单位为微克每克 （ g/g） 或微克每毫升（ g/mL） ； A 样 检材 样品提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克 （ g） ； V 样 检材 样品 的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品 的取样量，单位为克 （ g） 或毫升 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 7.2.3.1.2 外标 -标准曲线法 记录样品提取液和基质标准
15、工作溶液平行进样 2 3次的目标物保留时间和峰面积值， 以红霉素或罗 红霉素定量离子对的峰面积（ A样 ） 为纵坐标、红霉素或罗红霉素质 量浓度（ W）为横坐标进行线性回归， 得线性方程， 按公式（ 2）计算含量。 若检材样品中目标物的含量高于线性范围，应将 检材样品提取液 用甲醇稀释后进样分析。 GA/T 5 (2) 式中： W 检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； A样 检材样品提取液中目标物峰面积 平均值 ； a 线性方程的截距； b 线性方程的斜率。 7.2.3.2 计算 相对相差 记录 两 份平行操作的 检材样品中目标物的 含量，按公式（ 3
16、）计算相对相差： %10021 = X XXRD . (3) 式中： RD 相对相差， 用百分比 （ %）表示； X1、 X2 两个检材样品平行定量测定的含量数值； X 两个检材样品平行定量测定含量的平均值 。 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性 结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物 的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比 ， 相对偏差不超过表 3规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 红霉素和罗红霉素的相关谱图参见附录 A。
17、表 3 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加 样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断 检材样品中未检出目标物。 方法检出限参见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠 ， 应按 7.2重新提取检验。 红霉素和 罗红霉素中毒诊断参考资料 参见附录 B。 GA/T 6 A
18、A 附 录 A （资料性附录） 罗红霉素 和红霉素 的相关谱图 A.1 罗红霉素的 MRM总离子流图 见图 A.1。 图 A.1 罗红霉素 的 MRM总离子流图 A.2 罗红霉素的 MRM提取离子流图见图 A.2。 图 A.2 罗红霉素 的 MRM提取离子流 图 GA/T 7 A.3 红霉素的 MRM总离子流图见图 A.3。 图 A.3 红霉素的 MRM总离子流图 A.4 红霉素的 MRM提取离子流图见图 A.4。 图 A.4 红霉素的 MRM提取离子流图 A.5 LC-MS 分析，红霉素和罗红霉素检出限均为 1.0ng/mL（ g）。 GA/T 8 B B 附 录 B （资料性附录） 红霉素
19、和 罗红霉素 中毒诊断参考资料 B.1 中毒症状 红霉素主要的不良反应为 胃肠道 反应，可有恶心、 呕吐、腹痛及腹泻，反应与剂量大小有关 ；红霉 素可引起 过敏反应 ，可有荨麻疹及 药物热 ，并 可引起肝脏损害，如血清 丙氨酸氨 基转移酶 升高，出现 黄 疸 等 ； 静注或静滴 乳糖酸红霉素 可引起血栓性静脉炎，静注发生的可能性较多。肌注局部刺激性大，可 引起疼痛及硬结，因此不宜肌注 ；红霉素与氨茶碱类药物一起使用时，容易引起 恶心、呕吐、震颤、 抽 搐 ，乃至 心律失常 ，救治不及时易导致死亡。 口服罗红霉素不良反应相对轻微，主要为恶心、呕吐、胃痛、腹泻等胃肠道症状；静脉滴注罗红霉 素引起的
20、不良反应 中以皮肤黏膜损害反应发生率最高，该系统的损害较表浅，常以皮疹、斑丘疹伴瘙痒 等较明显症状为主，容易被观察到 ； 罗红霉素引起过敏性肝炎 或过敏性休克 并 最终导致死亡 。 B.2 中毒死亡机理 红霉素和 罗红霉素 等大环内脂类抗生素 以半抗原复合物的形式获得抗原性致敏 T细胞，并产生 T细 胞介导的细胞毒及抗体依赖细胞介导的细胞毒 (ADCC)，且促发巨噬细胞激活因子的生成从而形成以胆 淤为主要病理变化的过敏性肝炎，可伴有程度不等的肝细胞坏死，可致急性肝功能衰竭引起死亡。 B.3 红霉素和 罗红霉素 的中毒浓度 红霉素：小鼠口服为 2.93 g/kg 3.11g/kg， 大鼠口服为 大于 3g/kg。 罗红霉素： 小鼠 腹腔注射 为 435mg/kg，口服为 1397mg/kg。 _
