1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 血液、尿液 中百草枯 检验 气相色谱和气相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for paraquat in blood and urine samples GC and GC-MS - -发布 - -实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准
2、化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1） 提出并 归口。 本标准 起草 单位： 中国刑事警察学院 。 本标准起草人： 张婷、朱昱、陈学国、宋辉、邢丽梅、姜兆林、邹宁、齐宝坤 。 GA/T 1 法庭科学 血液、尿液 中百草枯 检验 气相色谱和气相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 血 液、 尿 液 中 百草枯 的 气相色谱（ GC）和气 相色谱 -质谱（ GC-MS） 定性定 量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 血 液、 尿 液 中 百草枯 的定性 分析和 定量 分析。 其他可疑 样 品中百草枯的定性 分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件
3、下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件 ， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求 ，对生物检材进行提取、净化 、衍生化，采用气 相色谱法 或 气相色谱 -质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度比作为定性判断 依据；以峰面积为依据，采用外标法或内标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂
4、 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水。在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括： a) 环己烷 ； b) 6%高氯酸水溶液：取 72%高氯酸溶液 10mL，加入 水 110mL 混匀 ； c) 饱和氢氧化钠溶液 ； d) 20%硼氢化钠溶液：称取硼氢化钠固体 2.0g，加水 8.0mL 溶解并混匀 （ 现用现配 ） ； e) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准 物质溶 液： 根据 百草枯 标准物质的纯度， 称取适量， 用 水 配制 1.0mg/mL 百草枯 标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月 ； 2) 0.1mg/mL 标准工作 溶 液：移取 1.0mg/m
5、L 的 百草枯标准 物质 溶液 1.0mL，用 水 稀释并 定 容至 10mL，配制成 0.1mg/mL 百草枯标准 物质 工作溶液， 置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月 。 实验中所用 其他 浓度标准工作溶液均由 0.1mg/mL 标准物质溶液用 水 稀释得到 ； GA/T 2 3) 1.0mg/mL 内标溶液：根据 乙基百草枯 内 标 物质的纯度，称取适量， 用甲醇配制 1.0mg/mL 内标 物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 12 个月 ； 4) 0.1mg/mL 内标工作溶液： 移取 1.0mg/mL 的乙基百草枯 内标 溶液 1.0mL，用 水稀释并 定容 至 10mL，混匀，
6、密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 6 个月。实验中所用其他浓度的内 标溶液均由 0.1mg/mL 内标溶液用甲醇稀释得到 ； 5) 0.1mg/mL 基质标准 溶液 ： 取与检材基质相同的空白样品 ， 按 7.1.1.1 样品提取方式 提取 ， 得上清液，用上清液配制 成 0.1mg/mL 百草枯 基质标准物质 溶液 。 现配现用 。 其他浓度的 基质 标准物质溶液 由 0.1mg/mL 基质标准溶液 用上清液稀释得到 ； 6) 0.1mg/mL 基质内标溶液：取与检材基质相同的空白样品，按 7.1.1.1 样品提取方式提取， 得上清液，用上清液配制 成 0.1mg/mL 乙基百草枯基质 内标
7、 物质溶液 。 现配现用 。 其他浓 度的基质 内标物质 溶液由 0.1mg/mL 基质内标 溶液用上清液稀释得到。 注： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管； b) pH试纸： 范围 114； 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱仪 ： 配有氮磷检测器（ NPD）； b) 气相色谱 -质谱 仪 ： 配有电子轰击源（ EI）； c) 电子天平； d) 离心机； e) 振荡 器； f) 水浴锅； g) 移液器 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品 提取 7.1.1.1 沉淀蛋白 取血样 或尿液 检材 样品 1.0mL于具
8、盖离心管中 （若采用内标法，则加入内标 乙基百草枯 溶液，使内 标浓度为 0.5g/mL，混匀） ，加入 6%高氯酸溶液 1.0mL（若为尿液样品，不添加 6%高氯酸溶液） ， 振 荡 30s， 8000r/min离心 3min，分 离上 清液 ，按 7.1.1.2进行衍生化操作 。 7.1.1.2 衍生化 取 7.1.1.1上清液 ， 加入饱和氢 氧化钠溶液 0.1mL， 调节 pH值 大于等于 12， 再 加入 20% 硼氢化钠溶液 0.5 mL， 于 室温 反应 30min， 加 入 环己烷 0.5mL，振荡 30s， 8000r/min离心 3min， 取 上清液， 作为 检材样 品衍
9、生液， 供 GC-MS分析。 GA/T 3 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加百草枯标准物质， 作为添加样品（ 血液 添加样品的浓度为 0.5g/mL，尿液添加样品的浓度为 0.2g/mL），与检材样品平行 操作，得到空白样品衍生液 和 添加样品衍生液，同时对 基质标准溶液 衍生 ，得到 基质标准溶液 衍生液， 供 仪器 分析。 若采用内标法，不做添加样品，空白样品（不加内标）与检材平行操作，同时对 基质标准溶液 和 基 质 内标溶液 衍生化， 得到 空白样品、 基质标准溶液 及 基质 内标溶液 衍生液，供仪器分析。 7.1.2
10、 仪器检测 7.1.2.1 仪器 条件 7.1.2.1.1 气相色谱 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱 1： DB-5 毛细色谱柱 （ 30m 0.32mm 0.25m） 或 等效色谱柱 ； b) 色谱柱 2： HP-50+毛细色谱柱 （ 30m 0.32mm 0.25m） 或 等效色谱柱 ； 注： DB-5 和 HP-50+都 是 Aglient 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是 表示对 该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 c) 柱温： 100 保持 1min，以 20 /
11、min 的速率升温至 280，保持 5min； d) 检测器温度： 290； e) 进样口温度： 260； f) 载气：高纯氮 ； g) 流速 ： 2.0mL/min； h) 进样方式：不分流， 1min 后分流，分流比 5:1。 7.1.2.1.2 气 相色谱 -质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同 样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： RTX-5MS 毛细色谱柱 （ 30m 0.32mm 0.25m） 或等效色谱柱 ； 注： RTX-5MS柱是 Restek公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效
12、果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温： 100 保持 1 min，以 20 /min 的速率升温至 280，保持 5 min； c) 进样口温度： 260； d) 传输线温度： 260； e) 离子源温度： 200； f) 载气：高纯氦 ; g) 流速 1.0mL/min； h) 扫描范围： 50amu 200amu； i) 进样方式：不分流， 1min 后分流，分流比 5:1； j) 百草枯 及内标物质 衍生物的特征离子见表 1。 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白 、 添加样品及 基质 标准 溶液 的 衍生液 （若采用内标法， 分别吸取检材、空白 、 基质 内标 溶液 及 基质标准
13、溶液 的 衍生液 ） ，按 7.1.2.1 的分析条件进样分析。 GA/T 4 表 1 百草枯及乙基百草枯衍生物的特征离子 检材 衍生物 特征离子 尿液 百草枯衍生物 m/z 96*， m/z 192*， m/z 194， m/z 148*， m/z150 乙基百草枯衍生物 m/z 110*， m/z 162*， m/z164, m/z 220*, m/z 222 血液 百草枯衍生物 m/z 96*， m/z 192， m/z 194*， m/z 148， m/z150* 乙基百草枯衍生物 m/z 110*， m/z 162， m/z164*, m/z 220, m/z 222* 尿液 基质
14、标准 溶液 百草枯衍生物 m/z 96*， m/z 192*， m/z 194， m/z 148*， m/z150 尿液基质内标溶液 乙基百草枯衍生物 m/z 110*， m/z 162*， m/z164, m/z 220*, m/z 222 血液 基质 标准 溶液 百草枯衍生物 m/z 96*， m/z 192， m/z 194*， m/z 148， m/z150* 血液基质内标溶液 乙基百草枯衍生物 m/z 110*， m/z 162， m/z164*, m/z 220, m/z 222* 标准物质 百草枯衍生物 m/z96， m/z192， m/z194， m/z148, m/z150
15、乙基百草枯衍生物 m/z 110， m/z 162， m/z164, m/z 220, m/z 222 注 ： *表示衍生物定性的特征离子， 百草枯衍生物和乙基百 草枯衍生物的定量离子碎片均为 m/z96。 7.2 定量分析 7.2.1 样品 提取 移取血液或尿液检材样品 1.0mL两份（若采用内标法，则加入内标乙基百草枯溶液，使内标浓度为 2g/mL），按 7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加百草枯标准物质作为添加样品（添加样品中 目标物含量应为检材样品中目标物含量的 (100 50)% ，若采用内标法，则添加样品中还需加入内标乙 基百草枯溶液，使内标浓度为
16、 2g/mL，混 匀），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得到空 白样品衍生液和添加样品衍生液 ，同时对 基质标准溶液 及 基质 内标 溶液 衍生，得到 基质标准溶液 及 基质 内标 溶液 衍生液，供仪器分析。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品 衍生 液及 基质标准溶液衍生液 （若采用内标法， 分别吸取检材、空 白和 内标物质衍生液 及 基质标准溶液衍生液 ） ，按 7.1.2.1 的分析条件每个样品进样分析 2 3 次。若要 报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。 7
17、.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 7.2.3.1.1 外标 -单点 法 记录各样品衍生液平行进样 2 3次的目标物峰面积值，按公式（ 1）计算含量： GA/T 5 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品中目标物的含 量，单位为微克每克（ g/g）或微克每毫升（ g/mL）； A 样 检 材样品 衍生 液中 目标物峰面积平均值； M 添 添加样品 中 目标物 添加 量，单位为微克（ g ）； V 样 检 材样品的定 容体积，单位为毫升（ mL）； A 添 添加样 品 衍生 液中目 标物峰面积平均值； M 样 检 材样品 的取 样量，单位为克（ g）或毫升
18、（ mL）； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升（ mL）。 7.2.3.1.2 内 标 -单点 法 记录各样品衍生液平行进样 2 3 次的目标物及内标物峰面积值，按公式 (2)计算校正因子 ， 按公式 (3)计算含量 ： 标内 内标 AM AMf = . (2) 式中： f 校正因子； M 标 添加样品中 目标物 添加量，单位为微克 (g)； A 内 添加样品中内标物峰面积平均值； M 内 添加样品中内标物添加量，单位为微克 (g)； A 标 添加样品中 目标物 峰面积平均值。 样内 内样 MA MAfW = . (3) 式中： W检材样品中目标物的含 量，单位为微克每克（ g/g）或微
19、克每毫升（ g/mL）； f 校正因子； A 样 检材样品衍生液中目标物峰面积平均值； M 内 检材样品中 内标物添加量，单位为微克 (g)； A 内 检材样品 衍生液 中内标物峰面积平均值； M 样 检材样品的取样量，单位为毫升 (mL)。 7.2.3.2 计算 相对相差 记录 两 份平行操作的 检材样品中目标物的 含量，按公式（ 3）计算相对相差： %10021 = X XXRD . (3) 式中： RD 相对相差， 用百分比（ %）表示 ； X1、 X2两个检材 样品 平行定量测定的含量数值； X 两个检材 样品 平行定量测定含量的平均值。 GA/T 6 8 结果评价 8.1 定性结果评
20、价 8.1.1 阳性结果评价 气相色谱法评价 ，在相同条件下进行样品测定时， 在色谱柱 1 和色谱柱 2 分析条件下，检材样品中 目标物的色谱峰保留时间与 基质标准溶液衍生液 一致（相对误差在 1%之内），且空白样品无干扰， 则 可判断检材样品中检出目标物 。必要时可通过 GC-MS 进行阳性结果确证。 气相 色谱 -质谱法 评价 ， 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与 基 质标准溶液衍生液 一致（相对误差在 1%之内），且在扣除背景后的检材样品质谱图中，目标物的质谱 特征离子（不少于 3 个）与 基质标准溶液衍生液 一致，特征离子丰度比与浓度接近的 基质标准溶液衍
21、生 液 相比，相对偏差不超过表 1 规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。 表 1 特征离子丰度比的最大允许相对偏差范围 特征离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 10 15 20% 50% 8.1.2 阴性结果评价 气相色谱法评价 ，在相同条件下进行样品测定时， 在色谱柱 1 或色谱柱 2 分析条件下，检材 样品 中 未出现与 基质标准溶液衍生液 保留时间一致的色谱峰，且在色谱柱 1 和色谱柱 2 分析条件下，添加样品 中均出现与 基质标准溶液衍生液 保留时间一致的色谱峰，空白样品无干扰， 则可判断检材样品中未检出 目标物。 气相色谱 -质
22、谱法评价 ， 检材样品中未出现与目标物一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物一 致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物 。 本方法的检出限参 见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。如果检材样品中 目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。应按 7.2重新提取检验。 百草枯衍生化反应原理及相关谱图参见附录 A，中毒诊断参考资料参见附录 B。 GA/T 7 附 录 A （资料性附录） 百草枯 衍生化反应原理及相关 谱图 A.1 本方法 血液的检出限为 0.2g/mL，尿液的检出限 为 0.1g/mL。
23、 A.2 百草枯与硼氢化钠还原反应原理见图 A.1。 H 3 C N N C H 3N a O HN a B H 4+ +H 3 C N N C H 3 (1) 或： H 3 C N N C H 3N a O HN a B H 4+ +H 3 C N N C H 3 (2) 图 A.1 百草枯与硼氢化钠的反应式 A.3 百草枯及乙基百草枯衍生物的相关质谱图及化合物结构 式见图 A.2图 A.6。 N N C H 3C H 3 百草枯 N NC H 3 C H 3 N N C H 3H 3 C 百草枯衍生物（ 1） 百草枯衍生物（ 2） N N C 2 H 5C 2 H 5 N NC 2 H 5
24、 C 2 H 5 乙基百草枯衍生物（ 1） 乙基百草枯衍生物（ 2） GA/T 8 说明： 色谱峰 1-百草枯衍生物 （ 1）； 色谱峰 2-乙基百草枯衍生物（ 1）； 色谱峰 3-百草枯衍生物（ 2）； 色谱峰 4-乙基百草枯衍生物（ 2） 。 图 A.2 百草枯衍生物和乙基百草枯衍生物的总离子流色谱图 z t 0 9 0 1 - 2 # 926 R T : 6 . 1 5 AV: 1 SB: 2 6 . 1 3 , 6 . 1 5 N L : 1 . 7 6 E 7 T: 0 , 0 + c E I F u l l m s 4 5 . 0 0 - 5 0 0 . 0 0 50 100 15
25、0 200 250 300 350 400 450 m / z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 96 148 122 94 134 9170 135 192120 97 149 81 16065 19158 162 193177 253223 231 266 313280 328 339287 401386351 371 411 431 453 467 493 图 A.3 百草枯衍生物 1的一级质谱图 z t 0 9 0 2 - 3 # 713
26、 R T : 5 . 4 2 AV: 1 SB: 2 6 . 1 4 , 6 . 1 6 N L : 8 . 1 9 E 7 T: 0 , 0 + c E I F u l l m s 4 5 . 0 0 - 5 0 0 . 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m / z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 96 70 150 122 72 94 136 151 162 19479 108 137 58 82 17
27、965 53 195 206 222 341267 281 401240 328297 313 357 376 478451422250 464429 485 图 A.4 百草枯衍生物 2的一级质谱图 GA/T 9 z t 0 9 0 1 - 2 # 1219 R T : 7 . 1 4 AV: 1 SB: 2 6 . 1 3 , 6 . 1 5 N L : 3 . 7 3 E 7 T: 0 , 0 + c E I F u l l m s 4 5 . 0 0 - 5 0 0 . 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m / z 0 5 10 15 20
28、25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 110 162 136 108 95 56 111 58 91 14982 220 97 163123 190 72 219 55 179 205 221 239 247 267 281 313 341 373 429294 324 352 390 415 455 475 489401 442 499 图 A.5 乙基百草枯衍生物 1的一级质谱图 z t 0 9 0 2 - 3 # 1014 R T : 6 . 4 5 AV: 1 SB:
29、 2 6 . 1 4 , 6 . 1 6 N L : 4 . 6 0 E 7 T: 0 , 0 + c E I F u l l m s 4 5 . 0 0 - 5 0 0 . 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m / z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 110 84 164 13686 58 176150108 111 79 222 15153 12272 177 193 207 67 223 441
30、233 250 281264 400308 427325 371295 331 409356 391 481461 489 图 A.6 乙基百草枯衍生物 2的一级质谱图 GA/T 10 A A 附 录 B （资料性附录） 百草枯 中毒诊断参考资料 B.1 理化性质 百草枯（又名见绿杀）， 是季铵盐类除草剂，纯品为白色结晶，易溶于水，微溶于乙醇、丙酮，不 溶 于烃类。 市售百草枯多为其二氯 盐 、双硫酸甲酯盐的绿色水溶剂 ，浓度以 20%和 2.5%水剂较为常见 。 B.2 中毒症状 百草枯对人、畜毒性大，口服后 2h以内出现血浓度高峰，胃肠道吸收比例少。通过胃肠道、呼吸道 及皮肤粘膜吸收的百草
31、枯，经电子传递而产生氧化物离子，这种离子与脂肪作用形成脂肪酸过氧化物， 它能破坏肺泡表面活性物质，抑制肺泡扩张，导致肺萎缩，肺部永久性损伤。 人口服百草枯后可引起口腔溃疡、食道炎、胃炎等，出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、肌肉震颤、惊 厥等症状，严重时可引起中毒性肾病、肺水肿和中毒性心肌炎。消化道 吸收 （ 48 96） h后有蛋白尿、 血尿及脓尿。该药可引起皮炎、损坏指甲、刺激眼睛。人吸收后鼻孔会出血。根据口服百草枯量的多少， 中毒者可于摄入后 24h至 （ 3 4） 周内死亡。 B.3 百草枯尸检所见 尸检可见两侧瞳孔散大，直径 0.5cm，各脏器充血，尤其以肺部出现明显的充血和水肿，肠及小肠 的上、中部含有红褐色泡沫样液体。肝有广泛性点状出血，肾盂周围可见出血点，心脏充血。 B.4 百草枯 的中毒浓度 人中毒多发生于口服较多量的百草枯水剂，口服百草枯量 20mg/kg 40mg/kg可引起慢性中毒，口 服量超过 40mg/kg可于数小时内死亡，也有的延后于数日内死亡。通常 2g/mL以上的血浓度就会致命。 一般百草枯中毒后可救治，但于数周后死亡的案例中血液中不能检出百草枯，此时从脏器中检出百草枯 能很好地证明百草枯中毒，所以血浓度与死亡的关系不易确定。吸收百草枯后 48h内，有 90%以原体形 式由尿排出。 _
