1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物 检材中地西泮及其代谢物 检验 液相色谱 和 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences Examination methods for diazepam and its metabolites in biological samples LC and LC-MS - - -实施 中华人民共和国公安部 发布 - -发布 GA/T I 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1 2009 给出的 规则 起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。 本文件的发布机
2、构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国 刑事技术 标准化技术委员会 毒物分析分技术委员会 （ SAC/TC 179/SC 1） 提出并 归口。 本标准起草单位： 山西医科大学 、公安部物证鉴定中心 、中国人民公安大学 。 本标准主要起草人： 贠克明 、 何毅 、崔冠 峰 、尉志文、任昕昕、王玉瑾、何洪源 、王乐乐 、何文婷 。 GA/T 1 法庭科学 生物检材中地西泮及其代谢物 检验 液相色谱和液相色谱 -质谱 法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物 检材 （ 血、尿、肝、肾、胃及胃内容等 ） 中地西泮 及其代谢物 （去甲 西 泮、 去甲羟基西泮、 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷、羟基 西
3、泮葡萄糖醛酸苷 ） 的高效液相色谱 （ HPLC） 及液相色谱 -串联 质谱 （ LC-MS/MS） 定性定量 检验方法 。 本标准适用于 法庭科学 生物 检材 中 地西泮 及其代谢物 （去甲西泮、去甲羟基西泮、去甲羟基西泮葡 萄糖醛酸苷、羟基西泮葡萄糖醛酸苷） 的 定性分析和定量分析。其他可疑样品中地西泮及其代谢物的定 性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的 。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 12
4、2 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定 的术语和定义适用于本 文件 。 4 原理 以空白样品和添加样品 作对照，按平行操作的要求， 对 生物检材 进行 提取、净化及浓缩 ， 采用 液相 色谱 -串联质谱法定性定量 ， 高效液相色谱法定量 ，以保留时间 、 质谱特征离子 和 离子 丰度 比 作为定性 判断依据； 以 峰面积 为 依据 ， 采 用 外 标法进行定量分析 。 5 试剂 和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。在分析中使用的试剂均为色谱纯，试剂包括： a) 甲醇 ； b) 醋酸铵； c) 氨水； d) 甲醇 /氨水 /水（体积比
5、5:2:93）混合溶液 ：移取甲醇 5mL、氨水 2mL，用水定容至 1000mL； e) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 地西泮、去甲西泮、去甲羟基西泮 标准物质溶液：根据 地西泮、去甲西泮、去 甲羟基西泮 标准物质的纯度， 各称取适量 ， 分别用甲醇配制 1.0mg/mL 地西泮、去甲西泮、 去甲羟基西泮 标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准 溶 液 ； 2) 0.1mg/mL 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷、羟基西泮葡萄糖醛酸苷标准物质溶液：采用市售 标准溶液； 3) 10.0g/mL 混合标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 的 地西泮、去甲西泮、去甲羟基西
6、泮 标准 GA/T 2 物质溶液各 0.1mL， 0.1mg/mL 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷、羟基西泮葡萄糖醛酸苷标准 物质溶液各 1.0mL， 用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存 。 有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由 10.0g/mL 标准物质溶液用甲醇稀 释得到； 4) 10.0g/mL 地西泮及其代谢物单一标准工作溶液 ：移取 1.0mg/mL 的地西泮、去甲西泮、 去甲羟基西泮标准物质溶液各 0.1mL， 0.1mg/mL 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷、羟基西泮 葡萄糖醛酸苷标准物质溶液各 1.0mL， 分别 用甲醇定容至 10mL，混匀 ，配
7、制成浓度为 10.0g/mL 的单一标准工作溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 3 个月。 实验中所 用其他浓度的 单一 标准工作溶液均由 10.0g/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到 。 注 ： 特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料 包括： a) 具盖离心管 ； b) 具塞玻璃试管 ； c) 固相萃取柱： C18柱或等效固相萃 取柱 ， 使用前 依次用甲醇、去离子水 活化 ； d) 一次性注射器 ； e) 有机系微孔滤膜： 0.22m。 6 仪器 和 设备 仪器和设备包括： a) 高效液相色谱仪 ： 配有紫外检测器 ； b) 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子
8、源 （ ESI） 和三重四级杆质量分析器 ； c) 电子天平 ； d) 离心机； e) 振荡器 ； f) 移液器 ； g) 浓缩 器 。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL 3.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 3.0g于具盖离心 管中， 加入水 3mL， 振荡 15min， 8000r/min离心 20min，取上清 液转移至 已 活化 的 C18固相萃取柱 中 ， 控 制上清液过柱 流速为 0.5mL/min， 依次用 水 1mL、甲醇 /氨水 /水（体积比 5:2:93） 混合溶液 1mL淋洗
9、， 抽 干弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min， 用甲醇 1mL洗脱 ，控制流速为 0.5mL/min， 收集洗脱液置于 浓缩器上 50浓缩 至干 ， 残留物 用 100L甲醇 溶解 ， 经 0.22m的有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液 供 LC-MS/MS分析。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空 白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加 地西泮、 去甲西泮、 去甲羟基西泮 、 去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷 和 羟基西泮葡萄 GA/T 3 糖醛酸苷 标准物质，作为添加样品（ LC-MS/MS添加样品的浓度为
10、 10ng/mL(g)），与检材样品平行操作， 得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 （ 液相色谱 -质谱条件 ） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： C18柱 （ 2.1 100mm， 1.7m） 或等效色谱柱； b) 柱温 ： 40； c) 流速： 0.4mL/min； d) 流动相： A： 乙腈 ， B： 0.1%甲酸 水 溶液 ； e) 洗脱：梯度洗脱，见表 1； 表 1 梯度洗脱 条件 时间 min A B 0 10% 90% 0.5 10% 90% 3.8 90% 10% 4.5
11、 90% 10% 4.7 10% 90% 5.5 10% 90% f) 离子化方式： 电喷雾离子 源 （ ESI） ； g) 检测方式： 正离子 ； h) 扫描方式 ： 多反应离子检测 （ MRM） ； i) 毛细管 电压： 5.5kV； j) 辅助气温度： 550 ； k) 辅助气 1 流量： 50psi， l) 辅助气 2 流量 ： 50psi； m) MS 参考条件（定性、定量离子对和去簇电压 和碰撞能 ）： 见表 2。 表 2 MS 参考条件 名 称 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 地西泮 285154* 40 40 285193 40 40 去甲西泮 271140* 50
12、30 271165 50 30 去甲羟基西泮 287269* 45 25 287241 45 30 羟基西泮葡萄糖醛酸酐 477283 30 20 477301* 30 30 去甲羟基西泮葡萄糖醛 酸酐 463269 35 20 463287* 35 32 注： *为定量离子 对 。 7.1.2.2 进样 分别 吸取检材 、 空白 和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 GA/T 4 移取血液等液体检材样品 1.0mL 3.0mL两份 ，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g 3.0g两份 于 具盖离心管中， 按 7.1
13、.1进行操作 。 另取等量 相似 基质的空白样品 三 份， 其中 两份分别添加 地西泮、去甲西泮、去甲羟基西泮、去甲羟 基西泮葡萄糖醛酸苷和羟基西泮葡萄糖醛酸苷 标准 物质 作为添加样 品 （ 添加样品中目标物含量应为检材 样品 中目标物含量的 (10050)%），另一份 作为空白样品，与检材 样品平行 操作 ， 得到 空白样品提取液 和添加样品提取液供 仪器 分析 。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器 条件 7.2.2.1.1 高效 液相色谱 -质谱 条件 按 7.1.2.1规定的 条件分析。 7.2.2.1.2 高效 液相色谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实
14、际情况进行调整： a） 色谱柱： C18柱（ 250mm 4.6mm， 5m） 或等效色谱柱； b） 柱温： 30； c） 流速： 0.8mL/min； d） 流动 相： 甲醇 /25mmol/L 醋酸铵溶液（ 体积比 50:50） ； e） 进样体积： 20L； f） 检测波长： 250nm。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液 及 标准工作溶液，按 7.2.2.1的 分析条件每个样品进样分析 2 3次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算 含量 记录各样品 提取液平行进样 2 3 次 的 目标物保留时间和峰 面
15、积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添 样添样 VMA VMAW = . (1) 式中： W 检材样品 中目标物的含量 ，单位为微克每克 （ g/g） 或微克每毫升（ g/mL） ； A 样 检材 样品提取液 中目标物峰面积平均值； M 添 添加样品中 目标 物添加量，单位为微克 （ g） ； V 样 检材 样品 的定容体积，单位为毫升 （ mL） ； A 添 添加样品 提取液 中目标物峰面积平均值； M 样 检材 样品 的取样量，单位为克 （ g） 或毫升 （ mL） ； V 添 添加样品的定容体积，单位为毫升 （ mL） 。 GA/T 5 7.2.3.2 计算相对相差 记录 两 份平行操作
16、的 检材 样品中目标物的 含量，按公式（ 2）计算相对相差： %10021 = X XXRD . (2) 式中： RD 相对相差 ， 用百分比（ %）表示 ； X1、 X2 两个检材 样品 平行定量测定的含量数值； X 两个检材 样品 平行定量测定含量的平均值。 8 分析结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的 标准溶液相比，相对偏差不超过表 3规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目
17、标物。 相关高效液相色谱和液相色谱 -串联 质谱图参见附录 A。 表 3 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50% 20 50 10 20 10% 最大允许相对偏差 20 25 30% 50% 8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱 峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。 LC-MS/MS分析， 地西泮及其代谢物的检出 限 参 见附录 A。 8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD 20%，定量 数据可靠，其含量按 两 份检材的平均值计算。如果 检材样品 中 目标物含量的 RD20%，定量数
18、据不可靠。 应 按 7.2重新提取检验。 GA/T 6 附 录 A (资料性附录 ) 地西泮及其代谢物 的 相关 谱图 A.1 地西泮及其代谢物 的检出限 地西泮、去甲西泮、去甲羟基西泮 检 出 限为 1ng/mL（ g） ；去甲羟基西泮葡萄糖醛酸苷和羟基西泮 葡萄糖醛酸苷检出限为 5ng/mL（ g）。 A.2 地西泮及其代谢物 的高效 液相色谱图 地西泮及其代谢物的 高效 液 相色谱图 见图 A.1。 说明 ： 1-地西泮，保留时间为 34.1 min； 2-去甲地西泮，保留时间为 30.8 min； 3-去甲羟基 西泮，保留时间为 23.4 min； 4-去甲羟基 西泮葡萄糖醛酸苷，保留
19、时间为 11.1 min； 5-羟基 西泮葡萄糖醛酸苷，保留时间为 14.5 min。 图 A.1 地西泮及其代谢物 的高效 液相色谱图 A.3 地西泮及其代谢物液相色谱 -质谱 图 地西泮及其代谢物的液 相色谱 -质谱 图 见图 A.2。 1 2 3 4 5 GA/T 7 说明： 1-地西泮，保留时间为 3.30 min； 2-去甲地西泮，保留时间为 3.00 min； 3-去甲羟基 西泮，保留时间为 2.68 min； 4-去甲羟基 西泮 葡萄糖醛酸苷，保留时间为 1.65 min； 5-羟基 西泮葡萄糖醛酸苷，保留时间为 1.52 min。 图 A.2 地西泮及其代谢物 的 LC-MS 谱图 _
