1、ICS 65.020.20B21 DB5306昭 通 市 地 方 标 准DB5306/T 192019代 替 DG5306/T 192014昭 通 市 马 铃 薯 脱 毒 苗 生 产 技 术 规 程 2019 -11-15发 布 2019-11- 15 实 施昭 通 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB5306/T 192019 I 前 言本 规 程 按 照 DB/T1.1 2009 规 程 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 规 程 由 云 南 省 昭 通 市 农 业 科 学 院 提 出 。本 规 程 由 昭 通 市
2、 农 业 农 村 局 归 口 。本 规 程 起 草 单 位 ： 昭 通 市 农 业 科 学 院 。本 规 程 主 要 起 草 人 ： 宋 维 际 、 李 灿 辉 、 张 清 凤 、 胡 祚 。本 规 程 代 替 了 DG5306/T 19 2014。 DB5306/T 192019 1 昭 通 市 马 铃 薯 脱 毒 苗 生 产 技 术 规 程1 范 围本 规 程 规 定 了 马 铃 薯 脱 毒 核 心 苗 、 基 础 苗 、 栽 培 苗 的 生 产 技 术 。本 规 程 适 用 于 昭 通 市 马 铃 薯 脱 毒 核 心 苗 、 基 础 苗 、 栽 培 苗 生 产 。2 规 范 性 引 用
3、文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB5749 生 活 饮 用 水 卫 生 规 程 GB18133 马 铃 薯 脱 毒 种 薯NY/T1212 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 繁 育 技 术 规 程NY/T1606 马 铃 薯 种 薯 生 产 操 作 技 术 规 程YY0569 生 物 安 全 柜3 术 语 和 定 义
4、下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 规 程 。3.1 脱 毒 核 心 苗通 过 茎 尖 剥 离 获 得 的 符 合 GB 18133 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 的 再 生 苗 。3.2 基 础 苗 用 核 心 苗 扩 繁 的 苗 ， 基 础 苗 一 般 为 核 心 苗 第 一 代 起 继 代 扩 繁 22代 2代 ， 即 核 心 苗 在 保 苗 期 间 继 代 5代 7代 ， 基 础 苗 在 扩 繁 栽 培 苗 期 间 扩 繁 继 代 15代 2代 。3.3 栽 培 苗用 密 封 、 透 明 、 耐 高 温 的 材 料 如 玻 璃 瓶 、 耐 高 温 塑 料 袋 作 容 器 ， 以
5、生 产 为 目 的 ， 快 速 繁 殖 后 可 用 于移 栽 的 马 铃 薯 脱 毒 苗 。3.4 培 养 基为 马 铃 薯 脱 毒 苗 的 生 长 、 发 育 提 供 所 需 物 质 的 支 撑 物 。3.5 母 液将 培 养 基 的 成 份 配 制 成 相 应 浓 度 的 溶 液 或 混 合 溶 液 。 3.6 接 种在 无 菌 条 件 下 ， 将 处 理 好 的 植 物 组 织 材 料 放 置 到 培 养 基 上 的 操 作 过 程 。 DB5306/T 192019 2 4 脱 毒 种 苗 生 产4.1 仪 器 、 器 皿 与 试 剂4.1.1 仪 器 设 备 与 器 皿高 压 灭 菌
6、 锅 、 超 净 工 作 台 、 0.01 g感 量 天 平 、 0.0001 g感 量 天 平 、 空 调 、 光 照 培 养 箱 、 冰 箱 、 光 照培 养 架 、 紫 外 灯 、 枪 状 镊 、 专 用 组 培 剪 、 接 种 器 械 电 热 灭 菌 器 、 培 养 室 、 温 度 计 、 培 养 皿 、 带 透 气 盖 的组 培 瓶 、 烧 杯 、 量 筒 、 医 疗 手 推 车 、 周 转 用 箱 。4.1.2 试 剂75 酒 精 、 甲 醛 、 高 锰 酸 钾 、 泛 酸 钙 、 氢 氧 化 钠 、 盐 酸 、 MS培 养 基 （ Murashige and Skoog, 196
7、2）所 含 试 剂 。 4.1.3 培 养 基 制 作培 养 基 制 作 按 附 录 A 进 行 ， 质 量 标 准 按 附 录 B 执 行 。4.2 房 间 安 排 及 要 求4.2.1 灭 菌 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 高 压 灭 菌 锅 、 空 调 、 配 制 培 养 基 的 不 锈 钢 桌 、 灌 装 机 、 电 磁 炉 、 水 池 、 拖 把 池 。墙 面 及 房 间 顶 部 贴 墙 砖 ， 地 面 铺 白 色 防 滑 地 板 砖 。4.2.2 接 种 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 超 净 工 作 台 、 接 种 器 械 电 热 灭 菌 器 、 空 调 、 医 疗
8、 手 推 车 、 40W紫 外 灯 1 2盏 。接 种 室 须 设 缓 冲 间 于 进 门 处 与 室 内 间 距 100 cm， 用 5 mm白 玻 璃 隔 断 ， 隔 断 玻 璃 上 贴 警 示 彩 条 ， 进 培 养室 的 门 须 与 隔 断 门 对 角 开 ； 玻 璃 窗 为 双 层 密 封 窗 ， 雨 天 降 雨 0.5h后 可 开 窗 换 气 ； 墙 面 、 地 面 处 理 同 4.2.1。 4.2.3 光 照 培 养 室4.2.3.1 光 照 培 养 室 建 设培 养 室 宜 建 成 四 面 为 落 地 窗 、 顶 部 布 50 %比 例 玻 璃 的 密 闭 环 境 ， 墙 面
9、刮 腻 子 灰 滚 白 乳 胶 漆 或 贴 白墙 砖 ； 地 面 铺 白 色 防 滑 地 板 砖 ； 如 顶 部 为 全 玻 璃 ， 须 安 装 75 %遮 阳 网 ， 夏 季 加 盖 一 层 50 %遮 阳 网 ； 顶 部安 装 FFU； 门 的 密 封 性 要 好 ， 以 免 灰 尘 进 入 。 如 整 体 房 间 10 0 ， 应 用 玻 璃 隔 开 ， 隔 断 玻 璃 上 贴 警 示彩 条 ， 每 个 单 元 安 装 一 台 立 柜 式 空 调 ， 以 便 节 能 。4.2.3.2 培 养 架 制 作 和 摆 放用 万 能 角 钢 （ 表 面 喷 白 色 漆 ） 制 作 成 层 高 4
10、0 cm， 长 宽 依 光 照 培 养 室 大 小 设 计 制 作 ， 层 隔 板 用 3.8mm白 玻 璃 ； 培 养 架 之 间 摆 放 间 距 为 60 cm。4.2.4 药 品 室 室 内 主 要 仪 器 设 备 是 药 品 柜 、 天 平 、 冰 箱 ， 墙 面 、 地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.5 洗 涤 室 DB5306/T 192019 3 室 内 主 要 仪 器 设 备 是 洗 瓶 机 、 洗 涤 池 、 不 锈 钢 桌 ， 墙 面 、 地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.6 贮 藏 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 货 架 ， 墙 面 、 地 面 处 理
11、同 4.2.1。4.2.7 培 养 基 储 备 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 空 调 ， 货 架 ， 墙 面 、 地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.8 病 毒 检 测 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 酶 标 仪 、 洗 板 机 、 冰 箱 、 解 剖 镜 、 显 微 镜 ， 墙 面 、 地 面 处 理 同 4.2.1。4.2.9 生 化 室室 内 主 要 仪 器 设 备 是 光 照 培 养 箱 、 生 化 培 养 箱 、 冰 箱 ， 墙 面 、 地 面 处 理 同 4.2.1。 4.3 脱 毒 核 心 苗 的 获 取4.3.1 选 材选 择 种 植 在 2500 m高 海
12、拔 地 区 、 具 有 本 品 种 特 性 的 优 良 健 壮 单 株 的 薯 块 ， 或 本 品 种 的 原 原 种 50个 以 上 ， 待 芽 长 出 1 cm以 上 时 备 用 。4.3.2 高 温 处 理将 选 中 的 带 芽 薯 块 放 置 于 于 37 37.5 的 光 照 培 养 箱 内 9周 10周 ， 在 高 温 处 理 过 程 中 及 时 拣出 腐 烂 或 芽 已 全 部 死 亡 的 薯 块 。4.3.3 茎 尖 剥 离4.3.3.1 外 材 消 毒 切 下 芽 顶 部 （ 0.5 cm） ， 放 置 于 用 75%酒 精 进 行 表 面 消 毒 过 的 烧 杯 中 ， 上
13、 用 干 净 纱 布 封 口 ， 置 于 自来 水 下 冲 洗 数 小 时 ； 将 冲 洗 过 的 茎 尖 用 75%酒 精 消 毒 3 s 5s， 置 于 0.1%升 汞 （ HgCl2） 溶 液 中 消 毒 5min。然 后 在 无 菌 水 冲 洗 8次 10次 。4.3.3.2 茎 尖 剥 离在 超 净 工 作 台 上 、 40 双 筒 解 剖 镜 下 用 烧 红 冷 却 后 的 解 剖 针 挑 取 茎 尖 顶 部 0.1mm带 1 2个 叶 原 基 的组 织 。4.3.4 茎 尖 培 养4.3.4.1 培 养 基MS 0.05mg/L NAA 0.05mg/L 6-BA4.3.4.2
14、培 养 条 件 将 培 养 瓶 放 置 于 3000 lux的 洁 净 光 照 培 养 室 内 ， 温 度 22 25 ， 光 照 12 h/d。4.3.5 扩 繁待 长 成 带 4个 5个 真 叶 的 小 植 株 进 进 行 扩 繁 出 5瓶 8瓶 ， 每 瓶 10苗 。 操 作 按 附 录 C执 行 。 DB5306/T 192019 4 4.3.6 送 检将 扩 繁 后 的 瓶 苗 送 检 ， 检 测 对 象 为 GB 18133 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 所 列 的 病 原 物 。4.3.7 扩 繁 微 型 薯将 合 格 的 数 个 茎 尖 苗 扩 繁 后 在 防 虫 网 室 中 各
15、 生 产 微 型 薯 100粒 以 上 。4.3.8 田 间 签 定对 各 茎 尖 的 微 型 薯 在 春 季 种 植 在 二 年 内 未 种 植 过 马 铃 薯 的 大 田 中 进 行 品 种 真 实 性 签 定 。4.3.9 扩 繁 基 础 苗根 据 计 划 所 需 苗 量 和 栽 苗 时 间 扩 繁 基 础 苗 。 操 作 按 附 录 C执 行 。4.3.10 基 础 苗 检 测 在 扩 繁 栽 培 苗 前 采 用 五 点 取 样 法 ， 随 机 抽 取 1 2 的 基 础 瓶 苗 进 行 检 测 。 检 测 方 法 应 符 合 GB18133 马 铃 薯 脱 毒 种 薯 附 录 的 要
16、 求 。 确 认 无 检 测 对 象 后 ， 方 可 扩 繁 栽 培 苗 。4.4 栽 培 苗 的 培 养 与 炼 苗4.4.1 培 养把 接 种 好 的 瓶 苗 置 于 22 2 ， 光 照 强 度 3000 lux 50000 lux， 光 照 时 间 14 h/d的 培 养 室 内 进 行培 养 。 3月 9月 培 养 20 d左 右 、 10月 翌 年 2月 培 养 25 d左 右 ， 可 获 得 具 有 5片 6片 小 叶 、 高 6 cm左 右的 小 苗4.4.2 炼 苗将 室 内 培 养 的 苗 在 移 栽 前 5 d 7 d置 于 有 遮 光 和 控 温 设 施 的 炼 苗 室
17、 或 荫 棚 内 炼 苗 ， 温 度 和 光 照 强 度分 别 控 制 在 25 2 、 3000lux50000lux。 4.4.3 栽 培 苗 质 量苗 高 5 cm 8 cm， 茎 粗 1 mm， 具 有 明 显 叶 柄 的 小 叶 5片 ， 根 白 色 至 浅 黄 色 ， 根 系 完 整 。4.5 栽 培 苗 的 清 洗 与 消 毒将 瓶 苗 取 出 ， 置 于 自 来 水 中 漂 洗 3次 4次 。 对 附 着 的 培 养 基 则 用 拇 指 与 食 指 轻 压 反 复 漂 洗 除 去 ， 切不 可 搓 捻 ， 以 防 损 伤 苗 而 影 响 成 活 率 。 漂 洗 干 净 后 即
18、可 用 0.05 的 高 锰 酸 钾 溶 液 浸 泡 10 min 2 min进 行 消 毒 ， 也 可 用 500倍 800倍 的 百 菌 清 或 甲 基 托 布 津 浸 泡 处 理 。5 组 培 室 卫 生按 附 录 D执 行 。 DB5306/T 192019 5 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）培 养 基 制 作A.1 母 液 配 制 MS培 养 基 母 液 配 制 表母 液 化 合 物 1L 用 量 (mg) 放 大 倍 数 称 量 数 (g) 母 液 体 积 (ml) 配 制 1L培 养 基 需 母 液 量 (ml) A NH4NO3KNO3MgSO47H2OKH2PO4C
19、aCl2H2O 16501900370170440 20 330380743488 10000 50B FeSO47H2ONa 2-EDTA 27.837.3 1000 27.837.3 5000 5C MnSO44H2OZnSO47H2OH3BO3KINa2Mo42H2OCuSO 45H2OCoCl26H2O 22.38.66.20.830.250.0250.025 1000 22.38.66.20.830.250.0250.025 1000 1D 肌 醇 100 1000 100 5000 5E 盐 酸 硫 胺 素 （ VB1）盐 酸 吡 哆 醇 （ VB6）烟 酸 （ Vpp）甘 氨 酸
20、 0.10.50.52 1000 0.10.50.52 1000 1F 泛 酸 钙 2 1000 2 1000 1注 ： 母 液 配 制 要 求 分 别 溶 解 后 再 定 容 。 在 配 制 母 液 A 时 氯 化 钙 最 后 加 入 并 且 溶 液 体 积 不 少 于 总 体 积 的 4/5。 在 配 制 母 液 B 时 定 容 前 应 煮 沸 30 分 钟 左 右 保 证 充 分 螯 合 。A.2 培 养 基 配 制A.2.1 培 养 基 配 方 DB5306/T 192019 6 马 铃 薯 脱 毒 种 苗 生 产 培 养 基 采 用 MS 泛 酸 钙 2 mg/L+蔗 糖 30g/L
21、+琼 脂 粉 4.2g 5.2g/L（ 依 琼 脂 粉 的强 度 标 准 定 量 ， 以 不 软 不 硬 为 准 ） 。A.2.2 琼 脂 粉 的 溶 化在 洁 净 的 不 锈 钢 锅 里 加 入 配 制 体 积 4/5左 右 的 清 澈 自 来 水 ， 加 入 所 需 的 琼 脂 粉 ， 置 于 电 磁 炉 上 煮 沸直 至 琼 脂 完 全 溶 化 为 止 。A.2.3 白 糖 的 溶 化把 所 需 的 药 品 和 蔗 糖 （ 或 食 用 白 糖 ） 加 入 琼 脂 溶 液 中 。A.2.4 定 容加 入 清 澈 的 自 来 水 并 最 终 定 容 至 所 需 体 积 。 A.2.5 调 整
22、 pH值充 分 混 合 后 用 1 N的 KOH（ NaOH） 或 HCl调 整 pH值 至 5.8 6.0。A.2.6 核 查 各 种 物 质仔 细 检 查 各 添 加 物 品 是 否 完 全 、 正 确 ， 如 无 遗 漏 或 差 错 即 可 分 装 。A.2.7 分 装在 培 养 基 完 全 凝 固 以 前 按 照 分 装 量 （ 30 ml/240ml瓶 ， 厚 度 18mm 1mm） 进 行 分 装 ， 分 装 时 注 意 培 养基 不 沾 培 养 瓶 口 ， 分 装 完 毕 后 尽 快 拧 紧 瓶 盖 ， 然 后 及 时 进 行 消 毒 灭 菌 。A.2.8 如 用 灌 装 机 制
23、 作 ， 按 灌 装 机 操 作 规 程 重 复 A2.2 A2.7程 序 。A.3 培 养 基 灭 菌 A.3.1 装 锅培 养 基 瓶 在 灭 菌 锅 内 不 得 倾 斜 。A.3.2 卧 式 高 压 锅 灭 菌装 锅 前 检 查 进 水 水 管 是 否 妥 善 连 接 水 箱 进 水 管 ， 是 否 无 漏 水 现 象 ， 将 水 箱 工 作 开 关 调 至 “ 加 热 ” 位置 ， 观 察 加 水 指 示 灯 是 否 正 常 加 水 。 设 置 参 数 为 灭 菌 室 温 度 121 （ 灭 菌 室 相 应 压 力 0.14Mpa） ， 灭 菌 时间 25min， 排 气 设 置 为
24、“ 微 排 ” 。A.3.3 立 式 高 压 灭 菌 锅装 锅 前 关 紧 放 水 阀 ， 往 外 桶 内 加 入 自 来 水 ， 水 位 至 灭 菌 桶 搁 脚 处 （ 挡 水 板 下 ） ， 装 入 盛 有 培 养 基 半成 品 的 组 培 瓶 后 ， 关 闭 、 锁 紧 灭 菌 锅 盖 ， 按 锅 上 设 置 按 键 设 定 A3.2条 的 灭 菌 参 数 （ 灭 菌 时 间 设 置 为 30min） ，灭 菌 结 束 蜂 鸣 声 响 起 后 关 闭 电 源 ， 待 其 冷 却 直 至 压 力 表 指 针 回 至 零 位 时 打 开 放 汽 阀 排 尽 余 汽 ， 打 开 外 桶 盖 才
25、 能 取 出 灭 菌 物 。A.4 灭 菌 后 的 物 品 应 及 时 转 运 至 培 养 基 储 备 室 摆 放 整 齐 。 DB5306/T 192019 7 BB附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）容 器 和 培 养 基 质 量 标 准B.1 用 瓶 质 量 标 准B.1.1 培 养 容 器 为 广 口 罐 头 透 明 玻 璃 瓶 。B.1.2 洗 涤洗 涤 溶 液 为 清 澈 透 明 加 有 洗 衣 粉 的 自 来 水 ， 在 25 水 温 下 ， 洗 衣 粉 用 量 （ 0.16g 0.17g/L） 。 B.1.3 裂 损 瓶 定 义瓶 口 缺 口 超 过 5mm的 和 裂 纹 瓶
26、。B.1.4 洗 后 质 量 标 准B.1.4.1 瓶 内 无 残 存 洗 衣 粉 ， 检 测 方 法 是 用 未 沾 有 洗 衣 粉 、 肥 皂 、 洗 洁 精 等 洗 涤 物 质 的 湿 手 指 ， 擦 试新 洗 出 的 瓶 内 、 外 壁 无 滑 溜 感 。B.1.4.2 表 面 无 原 有 标 签 印 记 。B.1.4.3 瓶 内 外 壁 无 污 物 、 无 污 痕 。B.1.4.4 洗 净 瓶 的 摆 放 和 晾 贮洗 净 后 的 瓶 需 反 扣 在 周 转 箱 或 筐 中 ， 堆 码 在 干 净 干 燥 处 ， 堆 码 高 度 不 超 过 150cm， 码 在 桌 子 上 的 可
27、堆 到 160cm， 用 前 瓶 内 外 不 能 有 明 显 的 水 痕 。B.2 培 养 基B.2.1 培 养 基 种 类MS+蔗 糖 30 g/L， 琼 脂 4.5 5.0 g/L， 灭 菌 前 pH5.8 6.0。B.2.2 配 制 母 液 用 水纯 净 水 。B.2.3 母 液 的 存 放配 制 好 的 母 液 贮 存 在 塑 料 桶 或 玻 璃 瓶 内 ， 标 记 清 楚 后 ， 除 大 量 元 素 外 都 存 放 在 4 5 的 冰 箱 内 。 各 母 液 桶 （ 瓶 ） 一 旦 标 记 好 后 ， 今 后 不 能 调 换 使 用 ， 下 次 使 用 时 只 能 贮 存 同 一 种
28、 贮 备 母 液 。B.2.4 配 制 培 养 基 用 水清 澈 透 明 的 自 来 水 。B.2.5 培 养 基 用 量 DB5306/T 192019 8 B.2.5.1 用 240ml瓶 做 栽 培 苗 时 ， 培 养 基 厚 度 为 18mm 1mm； 每 瓶 培 养 基 灌 装 量 为 30 mL 1.5 mL， 每 升培 养 基 灌 装 33瓶 1瓶 。B.2.5.2 用 350ml瓶 在 做 栽 培 苗 时 ， 培 养 基 厚 度 为 18mm 1mm； 每 瓶 培 养 基 灌 装 量 为 48mL 1.5mL， 每 升培 养 基 灌 装 21瓶 1瓶 。B.2.6 培 养 基
29、半 成 品 的 熬 制B.2.6.1 按 预 定 的 用 量 称 取 琼 脂 和 白 糖 ， 分 别 存 放 在 搪 瓷 钵 等 容 器 内 。B.2.6.2 在 用 于 熬 制 培 养 基 半 成 品 的 钢 精 锅 作 好 10L、 20L的 水 位 标 记 线 。B.2.6.3 用 钢 精 锅 装 好 预 定 量 3/4的 清 澈 自 来 水 ， 放 在 电 磁 炉 上 调 至 2000 档 位 ， 先 用 冷 水 浸 泡 琼 脂粉 5min， 待 水 沸 腾 时 放 入 琼 脂 ， 并 用 不 锈 钢 勺 不 停 搅 动 ； 当 水 快 开 时 将 炉 温 调 至 1000 档 位 ，
30、 随 后 往锅 内 倒 入 白 糖 ， 并 用 不 锈 钢 勺 不 停 搅 动 ， 至 琼 脂 白 糖 都 完 全 溶 化 时 关 闭 电 磁 炉 ， 加 入 母 液 ， 并 用 清 水 洗 2次 盛 母 液 的 容 器 ， 再 加 入 余 下 的 水 至 10 L或 20 L的 水 位 线 （ 此 阶 段 称 为 定 容 ） 。 经 充 分 搅 拌 后 ， 用 酸 度计 量 pH值 ， 用 1N盐 酸 （ HCl） 或 氢 氧 化 钠 （ NaOH） 或 氢 氧 化 钾 （ KOH） 调 整 pH值 至 5.8 6.0， 再 开 电 磁 炉将 锅 内 培 养 基 半 成 品 烧 至 沸 腾
31、时 关 闭 电 磁 炉 。B.2.6.4 用 不 锈 钢 勺 手 工 分 装 培 养 基 半 成 品 至 组 培 瓶 中 ， 按 B2.5培 养 基 用 量 装 入 。B.2.6.5 用 灌 装 机 灌 装 培 养 基 半 成 品 。 以 上 环 节 如 用 灌 装 机 时 按 灌 装 机 操 作 规 程 操 作 ， 当 灌 装 机 内 培养 基 半 成 品 中 的 琼 脂 粉 完 全 溶 化 时 ， 用 酸 度 计 量 pH值 ， 用 1N盐 酸 （ HCl） 或 氢 氧 化 钠 （ NaOH)调 整 pH值 至5.8 6.0， 再 打 开 灌 装 开 关 分 装 培 养 基 半 成 品 至
32、 组 培 瓶 中 。B.2.7 1N盐 酸 （ HCl） 和 1N氢 氧 化 钠 （ NaOH)的 配 制B.2.7.1 1N盐 酸 即 取 90mL37.01%的 盐 酸 （ HCl） 加 入 1000mL纯 净 水 中 轻 摇 匀 。B.2.7.2 1N氢 氧 化 钠 （ NaOH） 的 配 制 即 称 40g氢 氧 化 钠 （ NaOH)溶 于 1000mL纯 净 水 中 溶 解 。 B.2.8 成 品 培 养 基 的 存 贮成 品 培 养 基 堆 码 高 度 不 超 过 150cm（ 码 在 桌 子 上 不 超 过 160 cm） ， 摆 放 在 干 净 干 燥 处 ， 即 空 气 洁
33、 净度 30万 级 ， 温 度 23 1 、 相 对 湿 度 30% 40%的 密 闭 环 境 内 。 室 内 屋 顶 每 10 装 40W紫 外 灯 管 1支 或 每20 房 间 安 装 臭 氧 发 生 量 4 7g/h的 臭 氧 消 毒 机 1台 。B.2.9 培 养 基 存 贮 后 的 质 量 标 准B.2.9.1 外 在 质 量培 养 基 保 持 正 常 的 凝 固 状 态 ， 即 将 瓶 倾 斜 45 角 5s后 培 养 基 不 流 淌 、 轻 晃 瓶 后 培 养 基 不 散 ； 表 面 平整 光 滑 ； 瓶 口 以 下 内 外 壁 均 无 培 养 基 ； 培 养 基 内 有 少 量
34、 的 直 径 为 1mm（ 芝 麻 大 小 ） 以 下 气 泡 为 正 常 现 象 ；瓶 盖 松 脱 率 0.5%、 破 损 率 0.5%。B.2.9.2 内 在 质 量 存 贮 5天 后 的 污 染 率 0.5%。 DB5306/T 192019 9 CC附 录 C（ 规 范 性 附 录 ）无 菌 操 作 技 术C.1 接 苗 前 的 准 备C.1.1 超 净 工 作 台 的 使 用超 净 工 作 台 标 准 须 符 合 YY 0569-2005 生 物 安 全 柜 标 准 。 开 启 电 源 开 关 ， 启 动 鼓 风 机 使 超 净 工 作 台 处 于 工 作 状 态 ， 同 时 打 开
35、 超 净 工 作 台 上 的 紫 外 灯 对 超 净 工 作 台 的 台 面 进 行 消 毒 （ 接 种 时 关 闭 ） ， 20min后 即 可 使 用 。C.1.2 开 启 室 内 紫 外 灯 30min。C.1.3 换 鞋 。C.1.4 洗 手 ， 先 用 洗 手 液 洗 ， 在 自 来 水 上 冲 洗 2 3min， 再 用 75%酒 精 喷 手 抹 匀 。C.1.5 穿 戴 整 齐 工 作 服 、 口 罩 、 帽 子 ， 将 手 机 存 入 衣 帽 柜 。C.1.6 关 闭 紫 外 灯 。C.1.7 检 查 接 种 室 窗 子 是 否 完 全 关 闭 ， 如 有 开 着 的 窗 子
36、， 应 关 闭 。C.1.8 将 当 节 或 当 天 需 用 的 培 养 基 、 灭 过 菌 的 吸 水 纸 （ 每 人 每 节 工 作 时 间 两 包 灭 菌 纸 ） 等 送 入 接 苗 室 。C.1.9 每 个 接 苗 时 段 只 能 安 排 一 个 编 号 的 基 础 苗 进 入 接 种 室 。C.1.10 将 灭 过 菌 的 镊 子 、 剪 刀 插 入 灭 菌 器 内 灭 菌 ， 850 电 热 灭 菌 器 应 严 格 按 使 用 说 明 书 轻 插 器 具 、每 隔 3h调 至 低 温 档 冷 却 后 才 重 新 调 至 850 使 用 的 规 定 。C.1.11 核 查 基 础 苗
37、 的 标 签 是 否 完 整 和 有 无 污 染 。C.1.12 用 酒 精 擦 试 超 净 工 作 台 内 腔 壁 等 接 种 仪 器 、 工 具 。C.1.13 将 一 次 所 需 接 苗 量 的 培 养 基 （ 4 8瓶 ） 用 75%酒 精 擦 试 后 摆 在 超 净 工 作 台 一 侧 。C.2 接 苗 C.2.1 检 查 核 实 当 节 各 自 的 基 础 苗 的 编 号 是 否 完 全 为 同 一 个 编 号 、 标 签 是 否 完 整 无 误 、 是 否 有 污 染 。C.2.2 用 75%酒 精 浸 湿 灭 过 菌 的 吸 水 材 料 如 纯 棉 口 罩 或 小 手 帕 擦
38、试 培 养 基 瓶 和 基 础 苗 瓶 。C.2.3 将 灭 过 菌 的 吸 水 纸 用 镊 子 夹 出 后 反 铺 在 超 净 工 作 台 上 ， 每 次 四 张 、 各 两 层 。C.2.4 轻 旋 松 开 培 养 基 瓶 盖 。 DB5306/T 192019 10 C.2.5 以 一 瓶 基 础 苗 为 一 个 接 苗 单 元 ， 用 灭 好 菌 并 冷 却 了 的 剪 刀 在 瓶 内 将 苗 从 基 部 剪 断 ， 并 用 剪 刀 夹出 轻 放 在 吸 水 纸 上 ， 在 此 操 作 过 程 中 瓶 口 不 得 离 开 超 净 工 作 台 送 风 区 域 。C.2.6 将 每 一 苗
39、 剪 成 带 有 1个 叶 片 的 茎 段 ， 苗 尖 部 分 带 2个 以 上 完 整 叶 片 ， 苗 尖 部 分 另 放 ； 过 长 茎 段 上如 无 小 叶 应 剪 除 。C.2.7 将 培 养 基 瓶 盖 取 放 在 超 净 工 作 台 或 待 用 的 培 养 基 瓶 上 ， 盖 口 向 上 。C.2.8 将 茎 段 、 苗 尖 分 开 均 匀 正 插 （ 苗 要 插 入 培 养 基 1mm） 或 平 铺 于 培 养 基 表 面 ， 平 铺 时 应 使 苗 与 培养 基 紧 密 接 触 。 每 瓶 接 苗 数 量 按 不 同 品 种 、 时 间 的 规 定 接 入 茎 段 量 。C.2
40、.9 每 接 完 一 瓶 应 及 时 轻 盖 好 已 接 好 苗 的 瓶 子 ， 盖 时 瓶 盖 不 得 擦 碰 到 瓶 外 壁 ， 待 接 完 一 瓶 基 础 苗 （ 母瓶 ） 后 再 将 接 好 苗 的 瓶 子 盖 紧 或 扎 紧 。C.2.10 每 接 完 一 个 编 号 的 苗 均 应 及 时 在 瓶 上 写 上 与 基 础 苗 （ 母 瓶 ） 完 全 一 致 的 编 号 ， 再 写 接 苗 人 编 号 及 接 苗 时 间 。C.2.11 接 完 一 瓶 基 础 苗 后 更 换 吸 水 纸 、 剪 刀 、 镊 子 ， 并 重 新 擦 试 超 净 工 作 台 。C.2.12 操 作 过
41、程 上 不 得 将 接 苗 器 具 离 开 超 净 工 作 台 送 风 区 域 ， 接 苗 器 具 不 得 碰 到 苗 、 吸 水 纸 、 瓶 内壁 以 外 的 任 何 器 物 和 地 方 。C.2.13 接 苗 过 程 中 取 吸 水 纸 时 和 手 的 移 动 均 不 得 在 铺 好 的 吸 水 纸 上 经 过 。C.2.14 接 苗 过 程 中 剪 刀 和 镊 子 摆 放 时 应 摆 放 在 在 吸 水 纸 上 ， 但 要 注 意 未 进 入 灭 菌 器 灭 菌 的 部 分 不 得 与吸 水 纸 接 触 。C.2.15 接 苗 过 程 中 不 得 面 对 超 净 工 作 台 咳 嗽 和
42、频 繁 离 开 超 净 工 作 台 。C.3 接 后 工 作 C.3.1 每 接 完 一 个 编 号 的 苗 均 应 及 时 将 接 好 的 苗 送 入 培 养 室 按 培 养 室 管 理 规 定 摆 在 培 养 架 上 。C.3.2 每 天 接 完 苗 后 均 应 及 时 清 理 接 种 室 内 留 剩 余 的 空 瓶 、 封 口 膜 、 扎 瓶 线 及 其 他 需 清 理 的 物 品 。C.3.3 关 闭 室 内 超 净 工 作 台 电 源 、 电 热 灭 菌 器 电 源 和 其 他 电 器 如 取 暖 器 及 空 调 等 。C.3.4 将 抹 超 净 工 作 台 的 小 帕 子 晾 于
43、医 用 手 推 车 的 栏 杆 上 ,定 期 清 洗 小 手 帕 。C.3.5 准 确 记 录 并 于 第 二 天 与 培 养 室 管 理 人 员 核 对 当 天 的 接 苗 品 种 和 数 量 。C.3.6 清 洗 接 苗 工 具 （ 剪 刀 、 镊 子 ） 。C.3.7 关 好 接 种 室 。C.3.8 衣 帽 、 口 罩 摆 放 在 接 种 室 当 晚 用 紫 外 灯 灭 菌 。 C.4 其 他C.4.1 逢 阴 雨 天 降 雨 30min后 开 窗 换 气 30min。 DB5306/T 192019 11 C.4.2 注 意 超 净 工 作 台 及 其 他 仪 器 的 运 转 是 否
44、 正 常 。C.4.3 每 3个 月 为 一 个 周 期 ， 需 清 洗 或 更 换 超 净 工 作 台 过 滤 网 。C.4.4 需 对 接 种 室 进 行 每 月 定 期 甲 醛 +高 锰 酸 钾 熏 蒸 。 DB5306/T 192019 12 DD附 录 D（ 规 范 性 附 录 ）组 培 室 卫 生 标 准D.1 卫 生 标 准D.1.1 器 具 物 品 卫 生 标 准以 下 仪 器 设 备 表 面 及 常 开 内 腔 壁 应 保 持 无 尘 、 无 污 渍 、 无 杂 物 、 无 碎 玻 璃 。 D.1.1.1 超 净 工 作 台 。D.1.1.2 电 热 灭 菌 器 。D.1.1
45、.3 取 暖 器 。D.1.1.4 高 压 灭 菌 锅 。D.1.1.5 不 锈 钢 工 作 台 。D.1.1.6 空 调 外 部 、 顶 部 、 叶 扇 。D.1.1.7 其 他 物 品 的 内 外 表 面 。D.1.2 物 件 堆 放 整 齐 。 D.1.3 地 面 卫 生 标 准 接 种 室 ， 走 道 ， 光 照 培 养 室 ， 楼 梯 应 无 残 存 培 养 基 、 无 线 、 无 塑 料 膜 等 杂 物 。D.1.4 房 间 四 壁 无 污 痕 。D.1.5 水 池 所 有 眼 见 部 分 及 滤 渣 箩 筐 和 洗 拖 把 的 桶 应 无 污 斑 、 无 残 渣 、 无 碎 玻
46、璃 。D.1.6 拖 把 及 洗 拖 把 桶D.1.6.1 接 种 室 、 光 照 培 养 室 、 灭 菌 室 、 洗 涤 室 应 分 开 用 。D.1.6.2 在 桶 里 用 清 水 杵 5次 水 不 明 显 变 混 浊 。D.1.6.3 无 残 渣 、 头 发 绺 。D.1.7 扫 把 、 撮 箕 、 垃 圾 箩 无 残 存 培 养 基 、 无 厚 污 痕 、 无 残 渣 、 头 发 绺 。D.1.8 培 养 架 D.1.8.1 台 面 无 污 痕 和 手 试 后 无 尘 。D.1.8.2 万 能 角 钢 无 污 痕 。D.1.9 个 人 卫 生 DB5306/T 192019 13 D.
47、1.9.1 进 入 组 培 室 前 手 、 面 部 、 脚 不 得 有 明 显 污 痕 。D.1.9.2 指 甲 不 得 超 过 指 尖 、 指 甲 内 不 得 有 可 见 污 垢 。D.1.9.3 头 发 应 保 持 整 齐 无 明 显 污 痕 。D.1.9.4 鞋 袜 无 泥 土 ， 袜 子 须 每 天 清 洗 。D.1.9.5 外 衣 外 裤 无 明 显 污 痕 ， 无 泥 土 。D.1.10 其 他 部 分D.1.10.1 衣 帽 口 罩 无 汗 渍 、 可 去 除 污 痕 。D.1.10.2 围 腰 、 袖 套 、 防 水 手 套 无 明 显 污 痕 。D.1.10.3 铝 合 金
48、楼 梯 无 污 痕 。 D.1.10.4 门 及 楼 梯 扶 手 无 污 渍 污 痕 无 肉 眼 可 见 灰 尘 。D.1.10.5 培 养 室 玻 璃 门 槽 无 残 渣 和 碎 玻 璃 。D.1.10.6 培 养 室 顶 部 玻 璃 无 明 显 可 见 尘 土 。D.1.10.7 抹 布 用 清 水 搓 揉 5秒 钟 后 无 混 浊 。D.1.10.8 接 种 室 无 苍 蝇 、 蚊 虫 。D.1.10.9 灭 菌 室 洗 涤 室 工 作 时 间 内 不 得 有 超 过 1只 苍 蝇 或 蚊 虫 停 留 30min。D.1.11 不 得 在 组 培 室 用 餐 。D.1.12 客 用 白
49、大 褂 的 酒 精 消 毒 每 周 末 （ 星 期 五 或 星 期 六 ） 用 75%酒 精 喷 雾 消 毒 。 D.2 打 扫 卫 生 时 间D.2.1.1 每 天 必 须 打 扫 的 超 净 工 作 台 、 电 热 灭 菌 器 ， 走 道 、 门 厅 、 楼 梯 ， 拖 把 、 拖 把 池 ， 洗 瓶 机 、 灌装 机 ， 不 锈 钢 桌 台 面 。D.2.2 每 周 打 扫 2次 的 高 压 灭 菌 锅 ， 空 调 ， 撮 箕 、 扫 把 、 垃 圾 箩 筐 。D.2.3 每 两 周 打 扫 1次 的 除 以 上 两 条 规 定 的 仪 器 、 设 备 、 墙 壁 、 物 件 。D.2.4 清 洁 卫 生 开 始 时 间 每 天 下 午 规 定 下 班 时 间 后 开 始 。D.3 消 毒 剂 和 清 洁 剂 的 使 用D.3.1 75%酒 精 D.3.1.1 适 用 物 体 为 手 、 超 净 工 作 台 、 地 面 ， 所 有 房 间 顶 部 。D.3.1.2 除 地 面 、 房 间 顶 部 外 天 天 使 用 。D.3.1.3 地 面 、 房 间 顶 部 每 周 二 、 周 五 使 用 。 DB5306/T 192019 14 D.3.1.4 用 量 以 能 湿 润 物 体 表 面 为 准
