1、ICS 65.020.30 B 42 DB4107 新乡市 地方标准 DB 4107/T 434 2019 鸡蛋中四种 氟 喹诺酮类药物残留检测 液相色谱 -串联质谱法 Determination of quinolones residues in mussle of egg by liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2019 - 10 - 12发布 2019 - 11 - 01实施 新乡市市场监督管理局 发布 DB4107/T 434 2019 I 前 言 本标准依 据 GB/T 21312-2007 的要求，根据新乡市生产实际而制定
2、。 本标准附录 A为资料性附录。 本标准由 新乡市农业农村局、新乡市市 场监督管理局 提出。 本标准起草单位：新乡市畜产品质量监测检验中心 、辉县市农业农村局 。 本标准主要起草人： 李杰、高素敏、常守海、姚型鑫、王永梅 。 本标准于 2019年 10月 12 日 首次 发布。 DB4107/T 434 2019 1 鸡蛋中四种 氟 喹诺酮类药物残留检测液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本标准规定了 鸡蛋中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星及达氟沙星单个或混合药物残留的制样 、 超高 效液相色谱 -串联质谱法 的原理、试剂和溶液、仪器与设备 、方法步骤、 仪器参数与测定、 方法灵敏度 和精密度 。
3、本标准适用于 鸡蛋中 的 恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星及达氟沙星单个或 混合药物残留量的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必 不可少的。凡是注日期的引用文件，仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 农牧发 2003 1号 兽药残留试验技术规范（试行） 3 制样 3.1 样品的制备 取适量新鲜或冷冻的空白或供试样品，搅拌并使均匀。 3.2 样品的保存 -20 以下冰箱中贮存备用。 4 原理 供试样品中残留的喹诺酮类药物经磷酸盐缓冲液提取后，经 HLB固相萃取柱去除
4、杂质，浓缩后供液 相色 谱 -串联质谱法测定，外标法定量测定。 5 试剂和溶液 除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂盒符合 GB/T 6682规定的一级用水。 5.1 恩诺沙星 ： enrofloxacin,CAS:93106-60-6 中国兽医药品监察所。 5.2 环丙沙星 ： ciprofloxacin,CAS:85721-33-1 中国兽医药品监察所。 5.3 沙拉沙星 :sarafloxacin,CAS:98105-99-8 中国兽医药品监察所。 5.4 达氟沙星 :danofloxacin,CAS:74011-58-8 中国兽医药品监察所。 DB4107/T 434 201
5、9 2 5.5 摩尔数计数： 13.6/136.09/1000 mL=0.1 mol/L。 5.6 氢氧化钠溶液（ 5.0 mol/L）：取氢氧化钠 20 g 或饱和溶液 28 mL，加水稀释至 100 mL。 5.7 氢氧化钠溶液（ 0.03 mol/L）：取氢氧化钠溶液 5.0 mol/L0.6 mL，加水稀释至 100 mL。 5.8 磷酸盐缓冲液 0.1 mol/L（提取液）：取磷酸二氢钾 6.8 g，加水溶解并稀释至 500 mL（ pH 4.4）， 用 5.0 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 值至 7.0。 5.9 磷酸二氢钾：分析纯 。 5.10 磷酸 /三乙胺（ 0.05
6、mol/L）：取 85%磷酸 3.4 mL，用水稀释至 1000 mL（ pH 1.7），用三乙胺 调节 pH 值至 2.4。 5.11 洗脱液 ： 0.05 mol/L 磷酸溶液 /三乙胺 -乙腈（ 80+25） 5.12 乙腈： 色谱纯。 5.13 正己烷：分析纯。 5.14 甲酸：分析纯。 5.15 HLB 固相萃取柱 ： 规格 60 mg， 3 mL。 5.16 微孔滤头 ： 孔径 0.22 m。 5.17 喹诺酮类药物标准储备液 ： 分别称取恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星标准品各 0.0100 g，精密称定，置于 10.0 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，标准储备
7、液浓度为 1 mg/mL， -20保存，可保存 3 个月。 5.18 喹诺酮类 药物混合标准工作液 ： 准确量取喹诺酮类药物标准储备液各 0.1 mL，置 10.0 mL 棕色 容量瓶中，用甲醇稀释混匀，定容至刻度，浓度分别为 10 g/mL 的混合标准工作液。 6 仪器与设备 6.1 液相色谱串联质谱仪 ： 美国 Waters 公司 Waters Acquity UPLC-Xevo TQ-S。 6.2 天平 ： 感量 0.01 g。 6.3 分析天平 ： 感量 0.00001 g。 6.4 酸度计（ 0.01） 6.5 涡旋混合器 6.6 振荡器 6.7 低温离心机 6.8 氮吹仪 6.9
8、固相萃取装置 DB4107/T 434 2019 3 7 方法步骤 7.1 试料的制备 试料的制备包括：取搅拌均匀后的供试样品，作为供试试料； 取搅拌均匀后的空白样品，作为空白 试料；取搅拌均匀后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。 7.2 提取 称取 （ 20.02 ） g匀质样品，置于 50 mL离心管内，加入磷酸缓冲液 18.0 mL，涡旋混匀，中速振荡 30 min， 14000 r/min离心 10 min，倾取上清液，往上清液中加入 10 mL正己烷（脱脂），涡旋混匀， 中速振荡 2 min， 14000 r/min离心 5 min，取下清液 10 mL待净化。
9、 7.3 净化 7.3.1 HLB 固相萃取柱依次用甲醇 3 mL、再加磷酸盐缓冲液 3 mL 预洗。 7.3.2 鸡蛋下层提取液 10 mL 过柱。 7.3.3 用 3 mL 水淋洗，挤干。 7.3.4 洗脱液 2.0 mL 洗脱，挤干，混匀，过滤。待上机。 7.4 标准工作液的制备 准确吸取浓度为 1000 ng/mL的喹诺酮类药物混合标准溶液 0.01 mL，加入空白洗脱液中，同样品同 步处理，即工作液。 8 仪器参数与测定 8.1 色谱条件 8.1.1 色谱柱： Waters Acquity BEH C18 （ 2.1 mm 50mm， 1.7 m） 8.1.2 柱温： 30 8.1.
10、3 流动相： A：乙腈； B： 0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱（梯度洗脱程序见表 1） 表 1 色谱梯度洗脱程序 时间 (min) 流速 (mL/min) A B% 曲线类型 / 0.3 10 90 / 4 0.3 30 70 6 9 0.3 10 90 1 注： 1为即时变化， 6为线性变化。 8.1.4 进样量： 2 L DB4107/T 434 2019 4 8.2 质谱条件 8.2.1 离子源：电喷雾 ESI+ 8.2.2 扫描方式：正离子扫描 8.2.3 采集模式：多反应监测 MRM； 8.2.4 毛细管电压： 3.3 kV； 8.2.5 锥孔电压： 25.00 V； 8.2.6 离子
11、源温度： 150 ； 8.2.7 雾化温度： 500 ； 8.2.8 定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞电压见表 2。 表 2 喹诺酮类定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压 目标化合物 定性离子对 (m/z) 定量离子对 (m/z) 锥 孔 电 压 (V) 碰撞能量 (eV) 恩诺沙星 360.3316.4 360.3316.4 38.0 19.0 360.3342.3 23.0 环丙沙星 332.2314.3 332.2314.3 36.0 19.0 332.2288.3 17.0 沙拉沙星 386.3342.3 386.3342.3 40.0 18.0 386.3299.3 28.
12、0 达氟沙星 358.3340.3 358.3340.3 38.0 25.0 358.382.0 42.0 注： 准 确质量数在每次实验前进行调谐确认。 8.3 测定法 8.3.1 进样顺序 a) 试剂空白进 1 针； b) 标准工作液进 3 针，其 RSD10； c) 试剂空白进 1 针； d) 样品空白进 1 针； e) 样品 1-1 进 1 针； f) 样品 1-2 进 1 针 g) 样品 4-1 进 1 针； DB4107/T 434 2019 5 h) 样品 4-2 进 1 针； i) 阳性添加各进 1 针； j) 标准工作液进 2 针 8.3.2 定性需同时满足下列条件： a) 试
13、剂空白和样品空白不能出现与阳性添加相同的离子峰； b) 所有离子色谱峰的信噪比 (S/N)都在 3:1 以上，信噪比以峰对峰 (PtP)计算； c) 试样色谱峰的相对保留时间，应与标准溶液的相对保留时间一致，容许偏差为 2.5； d) 检测到的离子的相对丰度与标准溶液的相对丰度一致，容许偏差符合表 4 的要求。响应弱的离 子与响应强的离子丰度比即为相对丰度。 表 4 试样溶液中离子丰度比的允许偏差范围 相对丰度（ %） 允许偏差（ %） 50 20 20 50 25 10 20 30 10 50 8.3.3 定量方法 采用单点校准，按外标法以峰面积比计算，即得。 8.4 结果计算 按下式计算供
14、试组织中喹诺酮类药物的残留量（ g/kg）： 式中： X 试料中喹诺酮类的残留量 (g/kg)； A 试样溶液中喹诺酮类的峰面积； As 标准工作液中喹诺酮的峰面积； Cs 标准工作液中喹诺酮的浓度 (ng/mL)； V 样品定容体积 (mL)； m 供试试料的称样量 (g)； n 试样溶液稀释倍数。 注： 计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留 3位有效数字。 9 方法灵敏度和精密度 X= ACsV1000 n Asm1000 DB4107/T 434 2019 6 9.1 灵敏度 恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星 在鸡蛋中的检测限为 5 g/kg，定量限为 10 g/kg。 9.2 准确度 本方法回收 率为 60%120%。 9.3 精密度 本方法的批内相对标准偏差 20%，批间相对标准偏差 20%。 _
