1、ICS 65.020.30B23张 家 口 市 地 方 标 准DB1307DB 1307/T 341 2020马 铃 薯 脱 毒 试 管 （ 瓶 ） 苗 扩 繁 技 术 规 程 2020-07-29发 布 2020-08-13实 施张 家 口 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB1307/T 341 2020 2 前 言本标准按照GB/T 1.1规则起草。本标准由张家口市农业农村局提出并归口。本标准起草单位：张家口市种子管理站。本标准主要起草人：刘齐光、李金荣、杨博文、郑云、王曼、张永清、郭丽莎、吴印宗、杨晓红、赵祥、李艳清、马向辉、李中华、薛木易。 DB1307/T 341 2020
2、 3 马 铃 薯 脱 毒 试 管 （ 瓶 ） 苗 扩 繁 技 术 规 程1 范 围本标准规定了马铃薯脱毒试管（瓶）苗扩繁的术语和定义、扩繁工作室与扩繁操作技术规范。本标准适用于张家口地区马铃薯脱毒试管（瓶）苗的扩繁生产。2 术 语 和 定 义2.1 脱 毒 苗 经检测确认不带马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的试管苗和马铃薯帚顶病毒（PMTV）的试管（瓶）苗。2.2 核 心 苗经过茎尖分生组织培养技术获得的经检测无病毒，经试种观察具有原品种典型性状
3、的脱毒苗。2.3 基 础 苗由核心苗繁殖的经检测无病毒的脱毒苗。 3 扩 繁 工 作 室3.1 布 局 原 则脱毒苗生产工作室布局应遵循方便消毒，减少污染的原则，遵守操作流程。应具备更衣室、缓冲室、灭菌室、配制室、观察室、扩繁室、培养室等，各房间应隔离。周边环境应无污染，并与马铃薯生产田隔离。3.2 工 作 室 平 面 示 意 图 图 1 工 作 室 平 面 示 意 图 DB1307/T 341 2020 4 3.3 设 备 、 试 剂脱毒试管（瓶）苗生产的设备、试剂参见附录A。3.4 卫 生 要 求3.4.1扩繁室、培养室应保持卫生，定期消毒，每周至少消毒一次。3.4.2切繁前扩繁室应强制过
4、滤通风，并提前2 h开启紫外线灯，工作人员进入前关闭紫外线灯。切繁时扩繁室门窗应时刻紧闭，并保持干燥。3.4.3工作人员进入更衣室1，脱下外衣，换上拖鞋，签到处登记，然后进入更衣室2，换上新的拖鞋，穿好白大褂，戴上帽子到洗手池处用肥皂洗净双手，而后慢慢通过风淋室（风淋室内侧身两次），进入更衣室3，换上软底鞋经过缓冲室（缓冲室应有消毒装置，可放置消毒剂，进入时鞋底消毒）并穿上无菌衣和无菌鞋，进入扩繁工作区。操作过程工作人员双手和工作台面要经常用75%的酒精擦拭。3.4.4每次使用超净工作台前，应提前20 min打开紫外灯及风机。切繁时关闭紫外灯并打开照明灯 保持风机开启状态，超净工作台面及内壁用
5、75%酒精擦拭消毒，超净工作台换气滤网需每月更换一次。3.4.5操作使用的所有工具，使用前应高温灭菌。操作过程中镊子、剪刀、解剖刀等工具每次使用前接触植物材料的部分应灼烧或插入高温灭菌器中灭菌，冷却后使用，避免交叉污染。经灭菌的器械摆放在器械支架上。3.4.6发现污染材料及时清除出扩繁室，并做无害化处理。4 扩 繁 操 作4.1 培 养 基使用MS培养基（配方参见附录B）或其他培养基。4.2 试 管 （ 瓶 ） 制 作 将配制好的培养基装入容器中，每瓶培养基厚度15 mm左右，用封口膜（盖）封口；在121 122 灭菌锅中灭菌21 min22 min，取出后放置3 d7 d待用。如发现被污染的
6、培养基，及时清除。4.3 扩 繁 材 料 选 取选取经检测合格的基础苗。4.4 扩 繁 操 作4.4.1 试 管 （ 瓶 ） 口 灭 菌试管（瓶）口火焰灭菌，在拔封口膜（盖）前用火焰快速灼烧试管（瓶）口外侧，打开试管（瓶）后再瞬时灼烧试管（瓶）口及封口膜（盖）内侧。4.4.2 切 繁 在酒精灯火焰附近，一只手斜握培养瓶，另一只手拿剪刀剪取脱毒苗茎段放入试管（瓶）。根据基础苗长势，确定切断长度，确保每个茎段至少有一个腋芽和一片叶片。用定植针将茎段均匀的向上插入或平铺在培养基上，使腋芽与培养基充分接触。4.4.3 封 口切繁后旋转试管（瓶）口，火焰灭菌数秒后迅速封口。 DB1307/T 341 2
7、020 5 4.5 标 识在瓶壁上注明材料名称缩写、编号、接种人员代号和接种日期。4.6 培 养 条 件将切繁后的试管（瓶）放在培养架上。培养室白天培养温度18 22 ，光照17 h，光照强度2000 Lx3000 Lx，夜间温度15 18 。培养15 d20 d，待茎段长出78个叶片可再次切段扩繁。 DB1307/T 341 2020 6 附 录 A（ 资 料 性 附 录 ）脱 毒 试 管 （ 瓶 ） 苗 生 产 的 设 备 、 试 剂A.1 生 产 设 备A.1.1风淋系统A.1.2超净工作台A.1.3空调、冰箱A.1.4紫外灯A.1.5高压灭菌锅A.1.6培养架A.1.7器械灭菌器 A.
8、1.8器械柜A.1.9器械支架A.1.10酒精灯A.1.11镊子、剪刀、定植针、解剖刀A.1.12试管（瓶）A.1.13封口膜、橡皮筋、封口盖A.2 试 剂A. 2.1消毒剂A. 2.2 95%酒精、75%酒精A. 2.3 pH试纸A. 2.4附录B所用试剂 DB1307/T 341 2020 7 附 录 B（ 资 料 性 附 录 ）表 B.1 MS 培 养 基 储 备 液 配 制母液成分浓度（mg/L）每升培养基用量（mL）A硝酸铵（NH4NO3）33000 50硝酸钾（KNO3）38000磷酸二氢钾（KH2PO4）3400硫酸镁（MgSO 47H2O）7400氯化钙（CaCl22H2O）8
9、800B硫酸亚铁（FeSO47H2O）5570 5乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）7450C碘化钾（KI）166 5钼酸钠（Na2MoO42H2O）50硫酸铜（CuSO45H2O）5氯化钴（CoCl 26H2O）5硫酸锰（MnSO44H2O）4460硫酸锌（ZnSO47H2O）1720硼酸（H3BO3）1240D盐酸硫胺素（维生素B1）20 5盐酸吡哆素（维生素B6）100甘氨酸400烟酸100肌醇20000注：配置母液A时，最后加氯化钙；配置母液B时，分别溶解硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠，溶解时要一边加热一边搅拌，待两种溶 液都溶解后在混合在一起，继续加热使其充分螯合，冷却后用蒸馏水定容到1000mL；固体培养基配置：MS培养基储备液+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH为5.65.8。
