1、ICS 65.020.20 B 21 备案号：44859-2015 DB63 青 海 省 地 方 标 准 DB63/T 13602015 青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技 术规程 2015 - 02 - 09发布 2015 - 03 - 15实施 青海省质量技术监督局 发 布 DB63/T 13602015 I 前 言 本规程按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。 本规程负责起草单位：中国科学院西北高原生物研究所 本规程主要起草人：窦全文、雷云霆、王海庆、汪新川、喻凤、李媛、赵闫闫、陈志国、刘德梅、 杨文韬。 DB63/T 13602
2、015 1 青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定技术规程 1 范围 本规程规定了青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、SSR引物以及判定原 则等技术内容。 本标准适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、农技推广等单位对多年生牧草品种青牧1号 老芒麦真实性及纯度的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注明日期的应用文件，其最新版本（包括所有地修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 3 仪器、设备与试剂 仪器、设备与试剂见附录A 4 试剂配制 4.1 DNA
3、提取试剂 4.1.1 乙二胺四乙酸二钠盐溶液 称取EDTA-Na22H2O 9.306 g，加去离子水35 mL，剧烈搅拌，用NaOH颗粒0.8 g1.11 g调pH至8.0， 定容至50 mL，终浓度为0.5 mol/L。 4.1.2 三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液 称取Tris 6.06 g，加超纯水40 mL溶解，滴加浓HCl 1.8mL2.2 mL调pH至8.0，定容至50 ml，终 浓度为0.5 mol/L。 4.1.3 DNA提取液 称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）8 g，氯化钠32.7 g，三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液10 mL，乙二 胺四乙酸二钠盐溶液4 mL，混合，再用去离子水定容
4、至400 mL。 4.1.4 三氯甲烷和异戊醇混合液（24：1） 量取三氯甲烷240 mL和异戊醇10 mL，混匀。 4.1.5 70%乙醇 DB63/T 13602015 2 取无水乙醇70 mL加入到30 mL去离子水中，混匀。 4.1.6 10倍DNA溶解液 三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液10 mL，乙二胺四乙酸二钠盐溶液2 mL，先加入去离子水50 mL，溶 解混合均匀，再定容至100 mL，高温高压灭菌，室温保存。 4.1.7 1倍DNA溶解液 取10倍DNA溶解液10 mL，加入90 mL去离子水，混匀。 4.2 PCR扩增试剂 4.2.1 四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs：dATP、dC
5、TP、dGTP、dTTP）混合溶液 取浓度为100 mmol/ L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 储存液各25 L混合，加入去离子水900 L， 配成终浓度为2.5 mmol/ L 工作液。-20条件下保存。 4.2.2 引物稀释 用去离子水配制引物浓度为100 M 的储存液，取10 L储存液加人 90L 去离子水配成10 M工 作液。 4.3 聚丙烯酰胺凝胶试剂 4.3.1 5倍电泳缓冲液 分别称取Tris 54 g，硼酸27.5 g，放于1000 mL烧杯中，加入蒸馏水800 mL，充分搅拌溶解， 再加入乙二胺四乙酸二钠盐溶液20 mL，混匀，定容至 1 000mL。 4.3
6、.2 30%聚丙烯酰胺 分别称取丙烯酰胺29 g和甲叉双丙烯酰胺1 g，并放于100 mL 烧杯中，加入约蒸馏水80 mL，充分 搅拌，定容至100 mL，用滤纸过滤，于棕色瓶中 4保存。 4.3.3 10%过硫酸铵 称取过硫酸铵100 mg，并放于1.5 mL 离心管中。 加入蒸馏水1 mL，充分震荡，于4冰箱保存。 （保存期7 d） 4.3.4 1倍电泳缓冲液 取5倍电泳缓冲液500 mL，加去离子水2 000 mL，混匀。 4.3.5 加样缓冲液 称量EDTA 440 mg，溴酚蓝25 mg，二甲苯青 25 mg，置于500 mL烧杯中，向烧杯中加入去离子水20 mL，加热搅拌充分溶解，
7、加入甘油18 mL后，使用NaOH调节PH值至7.0，用去离子水定容至50 mL，室温 保存。 4.4 染色试剂 4.4.1 10mg/mL 溴化乙锭 DB63/T 13602015 3 称量溴化乙锭0.5 g，加入到50 ml容器中，加入去离子水50 ml，充分搅拌数小时完全溶解溴化乙 锭，将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4.4.2 凝胶染色液 取10mg/mL溴化乙锭溶液10 L，加入400 mL的去离子水，混匀。 5 引物 从老芒麦基因组中克隆和鉴定得到的SSR引物见附录B。 6 操作步骤 6.1 试样制备 青牧1号老芒麦种子单粒发芽成苗。 6.2 DNA提取 DNA提取步骤如下：
8、 a) 将DNA提取液在65水浴中预热。 b) 剪取长度为5 cm种子幼苗，置于2.0 mL的离心管中，加入2颗直径为0.5 cm的玻璃珠，在 组织研磨仪上以频率为30次/s研磨90 s。 c) 加入600 L预热的DNA提取液，置于65水浴锅中，恒温30 min，每5 min颠倒混匀一次。 水浴后置于室温下冷却。 d) 加入600 L氯仿/异戊醇混合液，混合均匀，置于20恒温摇床，震荡20 min，室温下1 0000 r/m离心10 min。 e) 小心吸取上层水相，置于新的1.5 mL的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，置于-20 冰箱中冷冻4小时，1 0000 r/m离心10 mi
9、n，轻轻吸取水相弃除，保留白色沉淀。 f) 加入500 L 70%的乙醇上下颠倒混匀5 min，静置1 min，吸取乙醇弃之，重复此操作2次。 g) 风干白色沉淀，加入40 L的1倍DNA溶解液，置于4冰箱，溶解24小时。 h) 用紫外分光光度计测定DNA溶液A260值和A280值，A260/A280的比值应在1.8-2.0之间。将DNA稀 释到50100 ng/L,置于-20冰箱保存。 6.3 PCR反应体系及程序 6.3.1 PCR反应体系 10PCR buffer 2.5 L，2.5 mmol/L dNTP 2.5 L，样品DNA 1 L，10 M SSR引物1 L，Taq酶 （5 UL
10、）0.3 L，加去离子水补足25 L作为反应体系。 6.3.2 PCR反应程序 PCR扩增程序如下，其中X为选用引物的退火温度，见附录B： a) 94预变性5 min。 b) 94变性30 s，X退火30 s，72延伸30 s。此步骤进行35个循环。 c) 72延伸10 min。 d) 4保存。 DB63/T 13602015 4 6.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 6.4.1 玻璃板处理 用自来水将玻璃板冲洗干净，晾干，再用95%乙醇擦洗一遍，干燥。 6.4.2 玻璃板组装 将玻璃板彻底干燥后，将两块玻璃板放入塑料胶条内，封装完毕后，用夹子固定在电泳槽上。 6.4.3 封口 用1 000 L移液枪将
11、1%的琼脂糖置于玻璃板边缘，凝固30 min，将玻璃板底部封住。 6.4.4 灌胶 将30%的丙烯酰胺13.3 mL，去离子水26.4 mL，5倍电泳缓冲液10 mL，10%过硫酸铵溶液500 L， 四甲基乙二胺（TEMED）40 L，轻轻混匀，缓缓灌入玻璃胶室，待胶室灌满之后，插入配套样品梳， 凝聚1 h。 6.4.5 预电泳 轻轻拔出样品梳，在电泳槽内倒入1倍电泳缓冲溶液至淹没较短的玻璃板，负极在上，正极在下接 通电路，打开电源100 W功率预电泳30 min，并赶走胶孔的气泡。 6.4.6 PCR扩增产物处理 在PCR产物中加入加样缓冲液，混匀。 6.4.7 电泳 将处理后的PCR产物，
12、用移液枪吸取5 L加入到胶孔中，150 W恒功率电泳，约1 h，关闭电源。 6.4.8 染色 拆下玻璃板，除去琼脂胶，将聚丙烯酰胺凝胶轻轻地从玻璃板剥离，放入凝胶染色液，染色10 min。 取出胶块，用清水冲洗1 min。 6.5 显像 将胶块置于凝胶成像分析仪中，记录结果并保存起来。 7 品种鉴定 按照GB/T 3543.2的规定，对待测品种进行取样，取其中100个待测个体制备试样以资料性附录B中 的SSR引物进行PCR扩增，若被测样品中所有SSR标记位点扩增条带与附录C和附录D中描述一致，可判定 为真实性青牧1号老芒麦种子。 8 品种纯度检测 品种纯度（P）的数值以%表示，按公式（1）计算
13、： DB63/T 13602015 5 %100 1 2 N N P .(1) 式中： P品种纯度； N1检测种子数； N2扩增条带符合标准图谱的种子数。 DB63/T 13602015 6 A A 附 录 A （资料性附录） 主要仪器设备及试剂 A.1 仪器设备 PCR扩增仪、垂直板电泳槽、高压电泳仪（600 V连续可调，0 mA400 mA连续可调，额定输出功率 为100 W）、恒温水浴锅（0100）、天平（精度0.01 g、0.0001 g各一台）、磁力搅拌机、高速 台式离心机（14 000 r/ min）、通量组织研磨仪、紫外分光光度计、紫外凝胶成像仪、高压灭菌锅、 酸度计、微量移液器
14、（10 L、100 L、1 000 L）、冰箱、脱色槽。 A.2 主要试剂 乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、三羟甲基 氨基甲烷（hydroxymethyl aminomethane，Tris）、盐酸 (HCl)、十二皖基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、三氯甲烷 （chloroform）、异戊醇（isoamyl alcohol）、氢氧化钠 （NaOH）、液氮、四种脱氧
15、核糖核苷酸（dNTPs: dATP、dCTP、dGTP、dTTP）混合榕液、引物（primer）、Taq DNA聚合酶（Taq polymerase）、丙烯酰 胺（acrylamide）、甲叉双丙烯胺胶（N，N - methyleme bisacrylamide）、四甲基乙二胺（tetramethyl ethylenediamine ，TEMED）、过硫酸胺（ammonium persaliate，APS）、硼酸（boric acid）、溴酚 兰（bromophenol blue）、二甲苯青（xylene cyanol）、溴化乙锭（ethidium bromide，EB）。 常规生化试剂等级要
16、求为分析纯。 A.3 主要耗材 离心管（1.5 mL、2 mL）、移液器配套吸头（10 L、200 L、1000 L)、96 孔PCR板或200 L PCR 薄壁管、一次性手套、玻璃板。 附 录 B （资料性附录） SSR引物及参考分子量 表A.1 SSR引物及参考分子量 名称 序列 退火温度（） 分子量（bp） ESGS1 F GGTGCTGTTTGTTTGTCT 45 180 DB63/T 13602015 7 R GAATGAAAGTTGCGGGTT ESGS4 F GTGCCCTATCAAGATTACG R TTCATCGGGACACCTTTT 50 200 ESGS25 F AAGT
17、GCCAACTAGGAGTT R CATCACCATTTTACAGGG 50 80 ESGS37 F GGTTTCAGACACCTGTTTA R CCAATGTATGTATCTAGCAAG 50 185 ESGS99 F AGTAGCTAAAAATGAGCAGGCT R CTTGTTGCAAACACTAGGGTAA 50 105 ESGS127 F GGAGGGGATAAAACTAAAGGT R ATCGTGCCAAATCAAGAATAC 55 230 B DB63/T 13602015 8 B C 附 录 C （资料性附录） 青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定电泳图谱 C.1 青牧1号与其它老
18、芒麦品种和材料的SSR电泳图谱 注1：M marker；1 同德老芒麦；2 青牧1号老芒麦；3 川草2号老芒麦；4 E6；5 NW048；6 NW043；7 PI 547394； 8 PI 619575；9 PI 504459；10 PI 531645 C.2 青牧1号品种群体鉴定SSR电泳图谱 注2：M marker；青牧1号品种个个体鉴定（箭头所指为多态性条带） 300bp 250bp 200bp 150bp ESGS1 ESGS4 ESGST25 100bp ESGS37 ESGS99 150bp 100bp ESGS127 300bp 200bp 300bp 250bp 200bp 3
19、00bp 250bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 200bp ESGS1 ESGS25 ESGS37 ESGS99 ESGS127 150bp 200bp 150bp ESGS4 100bp 200bp 150bp 100bp 300bp 250bp DB63/T 13602015 9 C D 附 录 D （资料性附录） 青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定模式图 D.1 青牧1号老芒麦SSR分子标记鉴定模式图 注1：黑色条带示青牧1号老芒麦品种鉴定特征条带，灰色条带示在部分个体中检测到的多态性条带。 _ 300bp 250bp 200bp 150bp 100bp ESGS ESGS ESGS3ESGS2 ESGS9 ESGS12Marke
