1、ICS 点击此处添加 ICS 号 点击此处添加中国标准文献分类号 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 10412011 大通牦牛细管冷冻精液 2011 - 12 - 19 发布 2012 - 02 - 01 实施 青海省质量技术监督局 发布 DB63/ T 10412011 I 前 言 本标准编写符合GB/T1.1 2009的要求。 本标准由青海省农牧厅提出并归口。 本标准起草单位：青海省大通种牛场。 本规范起草人：冯宇诚、殷满财、才加、武甫德、孙延生。 DB63/ T 10412011 1 大通牦牛细管冷冻精液 1 范围 本标准规定了大通牦牛细管冷冻精液的制作、规格、质量、检查方法及包
2、装标记、储存、运输等。 本标准适用于大通牦牛细管冷冻精液的制作、科研及教学。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY 1658 大通牦牛 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 采精 用人工模拟且有自然交配感的工具，以获得公牛精液的方法。 3.2 细管 为无毒、耐低温的专用塑料管。 3.3 细管冷冻精液 将精液用稀释液等温稀释、平衡后，分装入细管并封口，然后在液氮（-196 ）中快速冷冻。 3.4 大通牦牛 由中国农科院兰州畜牧与兽药
3、研究所、 青海省大通种牛场利用野牦牛作为父本， 通过与家牦牛杂交， 而培育出的牦牛新品种。 4 技术要求 4.1 采精种公牛 DB63/ T 10412011 2 应符合NY 1658规定的特等或一等大通牦牛公牛，体质健康，不允许有已发布的动物防疫法中所明 确的二类疫病中的任何一种病。 4.2 新鲜精液质量 4.2.1 呈乳白色或微黄色。 4.2.2 直线前进运动的精子60。 4.2.3 精子密度6x10 8 /ml。 4.2.4 精子畸形率12。 4.3 细管 4.3.1 细管外观 细管无裂痕，两端封口严密，印制的标志应清晰。 4.3.2 细管剂量、剂型 中型0.5 ml；微型0.25 ml
4、。 4.4 解冻每一剂量的细管冷冻精液 4.4.1 精子活力 0.3（指呈直线前进运动的精子百分率为30%）。 4.4.2 直线前进运动的精子数 800万个。 4.4.3 精子畸形率 20%。 4.4.4 细菌数 800个。 4.4.5 精子存活时间 在 储存时下限为12 h，在20 储存时下限为6 h。 5 冷冻精液的制作 5.1 采精准备 5.1.1 在牦牛配种季节（7 月10 月）进行采精。采精场所保持安静，地面保持清洁卫生并铺垫防滑 设施。 5.1.2 选择性情温顺、无疫病的母牛作台牛，并保定于采精架内。台牛的外阴、臀部和公牛体表及包 皮内腔采精前用清水冲洗干净。 5.1.3 假阴道润
5、滑剂（凡比士林与液体石蜡油按 1:1 的例调制）用水浴煮沸消毒。 DB63/ T 10412011 3 5.1.4 安装假阴道前应洗净双手，用 75 %的酒精棉球消毒假阴道内胎及三角漏斗，将三角漏斗安装于 假阴道上，接上集精管，套上保护套，假阴道内可提前注人 38 左右温水，并用消毒纱布将假阴道口 包裹好，放置于预先调整好温度 44 46 的恒温箱内待用。采精前在假阴道内胎的前 2/3 处用涂 抹棒均匀涂擦适量消毒过的润滑剂，并从活塞孔打气，使假阴道有适度（假阴道口呈三角形状为宜）的 压力。采精时温度控制在 38 42 之间。 5.2 采精方法 采精时饲养员与采精员要积极配合。采精员的动作要迅
6、速而正确，胆大心细，注意人、畜安全。采 精前先让公牛进行数次空爬使之有充分的性准备，待公牛性欲旺盛时采精。采精员右手持假阴道站在公 牛右后方， 当公牛起跳前肢爬上台牛时， 迅速向前用左手托着公牛包皮， 右手持假阴道与台牛成40角， 阴道口斜向下方， 左右手配合将公牛阴茎自然地引人假阴道口内 （不得用手捉拿阴茎、 假阴道去套阴茎） ， 公牛往前一冲即完成射精动作，公牛随即而下，采精员右手紧握假阴道，随公牛阴茎而下，待公牛前肢 落地时，缓慢地把假阴道脱出，立即将假阴道口斜向上方，打开活塞放气，使精液尽快地流人集精管内， 然后小心地取下集精管，迅速送至精液处理室。安装好的假阴道只能使用一次，不得重复
7、使用。成年公 牛每周采精两次，每次可连续采精两回（间隔30 min左右）。 5.3 新鲜精液质量检查 按本标准4.2要求判定。 5.4 精液处理 5.4.1 精液稀释液配制 5.4.1.1 卡苏牛用无菌无卵黄稀释液（法国进口，250 毫升/瓶） 先将1000 ml超纯水倒入量杯并放进水浴锅中（水浴锅温度 为32 34 ），同时把瓶装卡苏牛 用无菌无卵黄稀释液原液也放入水浴锅中，置15 min。取1瓶原液（250 ml）倒入1000 ml超纯水中稀释， 再用稀释液将原液瓶冲洗两遍，配成1250 ml稀释液即可使用。 5.4.1.2 常规冻精稀释液 5.4.1.2.1 第一液 蒸馏水 100 ml
8、，柠檬酸钠 2.97 g，卵黄 10 ml。 5.4.1.2.2 第二液 取第一液 41.75 ml，加入果糖 2.5 g，甘油 7 ml。 5.4.2 精液稀释操作 5.4.2.1 准备 凡接触精液的器皿消毒（洗净干燥）后放在30 35 恒温箱中，稀释液放在34 恒温水浴箱 中备用。盛装稀释精液的容器，应做明显标记，以防混淆。 5.4.2.2 密度测定 5.4.2.2.1 采集的新鲜精液通过专用窗口传递入精液处理室，及时记录牛号、采精量等有关数据，按 精液密度测定仪的操作规程准确进行精液的密度测定。 5.4.2.2.2 测出密度后通过计算或精液密度测定仪的相关程序获得应加稀释量、 可制作细管
9、数等信息。 及时记录牛号、密度、所加稀释液量、制作细管数等有关数据。 5.4.2.3 镜检精子活力 DB63/ T 10412011 4 取原精或稀释精液一滴于载玻片上，加盖盖破 片后在有恒温（38 ）装置的显微镜下估测评定活 力。镜检活力合格者进行稀释。 5.4.2.4 精液稀释平衡 5.4.2.4.1 卡苏牛用无菌无卵黄稀释液稀释后的平衡方法 将水浴锅中的精液（温度32 34 ）用配好的稀释液进行1：1的稀释，然后朝一个方向摇匀。 将稀释过的精液放入32 34 水浴锅中置10 min。再加入最终测量出的稀释总量，以缓慢的速度摇 匀。再在4 温度中平衡3 h5 h。 5.4.2.4.2 常规
10、稀释液稀释后的平衡方法 将所加稀释液分为二次添加，首先加入不含甘油的第一液，加至稀释总量的一半，降温、平衡后再 加足含有甘油的第二液。 5.4.3 精液冷冻 5.4.3.1 封装 用牛精液四头灌封机通过计算机程序控制设备的运转，使之自动、准确地把精液灌装到细管中，并 封存、打印标识。 5.4.3.2 上架 平衡、封装后的细管精液上架码放时应注意细管摆放的方向，把棉塞封口端靠近操作者，超声波封 口端远离操作者，入冷冻仪时亦应如此放置。每架上放一根类似于细管的标记物，一头牛用同一颜色的 标记物，便于识别。如同一架上有不同牛的细管精液，要分开码放，两头牛之间要隔开一些距离，以免 混淆。 5.4.3.
11、3 冷冻 5.4.3.3.1 全自动冷冻仪 冷冻仪是由电子计算机控制的全自动冷冻容器，可根据使用者的需要获取多条冷冻曲线。使用时首 先在电脑中设置好冷冻的最佳温度曲线，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至4 ，关闭风扇电源，待风扇 完全停止后方可把已排满待冻细管的架子（每15架重叠在一起）放入冷冻仪。操作要迅速，冷冻仪与低 温柜应尽量靠近。由电脑按预选的最佳冷冻曲线自动完成冷冻过程。如果所排细管不够30架，应用空架 补充满30，以获得最佳的冷冻效果。 5.4.3.3.2 自制的冷冻箱 如用自制的冷冻槽作冷冻器时，槽的深度应在50 cm以上。温度值控制在-140 左右，初冻温度调 节至-120 左右，冷
12、冻时温度回升的最高值不得高于-90 ，整个冷冻过程控制在8 min之内，此间所 指的冷冻温度是细管冷冻面的温度而非细管内的温度。 5.4.3.4 收集 冷冻完后打开盖子，冻精按牛号投入盛满液氮的不同的提筒中，细管的超声波封口端在上，棉塞端 向下，切不可倒置，并迅速浸泡在液氮中，液氮罐入临时贮存库。 DB63/ T 10412011 5 6 冷冻精液的检验方法 6.1 解冻 取细管冷冻精液投入到38 40 温水中直接解冻，然后取一滴压片镜检。 6.2 镜检 取解冻后的精液一滴于载玻片上，加盖盖破片后在有恒温（38 ）装置的显微镜下估测评定活力。 镜检活力合格者进行包装。 7 细管冷冻精液包装 用
13、细管计数分装机进行包装，包装应在-140 以下的环境中进行，包装后的细管其棉塞端在塑料 管的底部，不得倒置。塑料包装管的内径应均匀一致，不得用上口大、底部小的塑料管。按公牛品种、 牛号放入液氮容器内储存。 8 细管冷冻精液标记 8.1 每头公牛、每批冻精均应分别包装，细管和盛颗粒冻精的盛器外面均注明种牛品种、牛号、制作 日期和制作单位、数量及活力的标记。 8.2 大通牦牛：冻精容器（袋）及标签颜色为蓝色，代号 DT。 9 细管冷冻精液储存 细管冷冻精液应储存于液氮罐的液氮中，设专人保管，每周定时加一次液氮，应经常检查液氮罐的 状况，如发现液氮罐外壳结白霜，立即将精液转移入其他液氮罐内保存。取放细管冷冻精液时提漏按号 扣入定位槽内，提漏只准提升到容器颈下，不得提到容器外，提漏离开液氮面不得超过10 s。 10 运输 运输冻精时，应有专人负责，办好交接手续，途中应及时检查和补充冷源。 _
