1、ICS备案 号： 26842-2010青 海 省 地 方 标 准 DB63 DB63 DB63/T863 209实验室冬虫夏草真菌 -中国被毛孢 真菌保存技术规程 209-12-07发布 201-01-0实施青 海 省 质 量 技 术 监 督 局发布发布发布 发布 DB63/T863 2009 I 目 次前言 .II1范围 .12术语 .1 3菌种 制备 .13.2菌种 纯化 方法 .24菌种 保存 方法 .24.5冬虫 夏草 真菌 的保 存步 骤 .26保存 菌种 的复 壮 .3 DB63/T863 2009 I 前 言本规 程由 青海 省畜 牧兽 医科 学院 提出 并归 口。 本规 程由
2、青海 省畜 牧兽 医科 学院 草原 所负 责起 草。 本规 程起 草人 :李玉 玲、 马少 丽、 刘欣 、徐 海峰 、张 宗豪 。本规 程由 青海 省质 量技 术监 督局 批准 发布 。 DB63/T863 2009 1 实验室冬虫夏草真菌 -中国被毛孢1范围 本规 程规 定了 冬虫 夏草 真菌 分离 培养 后的 保存 技术 措施 。 本规 程适 用于 冬虫 夏草 真菌 中国 被毛 孢分 离培 养后 的保 存。2术语2.1中国 被毛 孢 （ HirsutellasinensisLiu,Guo,Yu&Zeng）指冬 虫夏 草的 无性 型。 2.2菌种 冬虫 夏草 体内 分离 出中 国被 毛孢 。
3、2.3无菌 操作 指采 用经 过一 定消 毒措 施处 理之 后的 环境 、器 具及 人为 操作 的工 作方 式。 2.4培养 基 是供 微生 物 、 植物 和动 物组 织生 长和 维持 用的 人工 配制 的养 料，一 般 都含 有 碳水 化合 物 、含 氮 物 质 、无机 盐（ 包括 微量 元素 ）以 及 维生 素 和水 等。 有的 培养 基还 含有 抗菌 素 和 色素 。2.5菌种 纯化 有一 种以 上的 微生 物培 养物 称为 混和 培养 物。 如果 在一 个菌 落中 所有 细胞 均来 自于 一个 亲代 细胞 ,那么 这个 菌落 称为 纯培 养 ，这 个过 程就 是菌 种纯 化 。2.6菌
4、种 衰退 菌种 在培 养或 保藏 过程 中 ,由于 自发 突变 的存 在 ,出现 某些 原有 优良 生产 性状 的劣 化、遗 传 标记 的 丢失等 现象 。 2.7菌种 保藏 就是 对活 体微 生物 群体 进行 有效 的保 藏的 生物 学方 法。2.8水活 度 (Aw)是影 响干 燥菌 种保 藏稳 定性 的重 要因 素。 3菌种 制备3.1菌种 纯化3.1.1纯化 菌种 用培 养基 配方3.1.1.1牛肉 汤的 制备 DB63/T863 2009 2 3.1.1.1.1先将 新鲜 牛肉 去除 筋和 脂肪 ，然 后取 1kg牛肉 加蒸 馏水 2kg放入 容器 内煮 沸， 煮沸约 40分钟 后将
5、肉渣 滤去 ，肉 水经 121 、 0.1MPa高压 灭菌 30min后备 用。3.1.1.1.2注 意 ： 煮沸 时应 边煮 边搅 动； 煮沸 前应 在容 器壁 上划 一刻 度， 煮 沸 时随 时添 补蒸 馏水 。3.1.1.1.3固体 培养 基（ 1000ml）： 牛肉汤 500ml、牛奶 200ml、葡 萄糖 30g、琼脂 18g、水 解乳 蛋白5g、酵 母浸膏 1g、磷 酸氢 二钾 1g、核 糖核酸 0.5g、硫 酸镁 0.2g，加 水定 容至 1000ml。3.1.1.2液体 培养 基： 液体 培养 基配 方不 加琼 脂外 ，按 照本 标准 3.1.1.1.3固体 培养 基制 备方
6、法进 行 制备 。 3.1.2培养 基的 制备3.1.2.1固体 培养 基： 按照 本标准 3.1.1.1.3中的 配方 ，依 次加 入水 解乳 蛋、 酵母 、葡 萄糖 、磷 酸氢二钾 、硫 酸镁 、核 糖核 酸和 琼脂 放入 容器 内加 热煮 沸溶 化后 备用 ；量 取牛奶 200ml加热 煮沸 后取 下备用； 将上 述溶 液和 牛肉 汤共 同放 入容 器中 加水 定容至 1000ml，煮 沸后 ，用 1N的盐 酸或 1N氢氧 化钠 调制 PH6.7，分 装于 试管 内（ 中试 管每支 6ml 7ml）， 115 、 0.075MPa灭菌 30min后取 出摆 成斜 面备 用。 3.1.2.
7、2液体 培养 基： 将上 述溶 液除 去琼 脂不 加， 和牛 肉汤 共同 放入 容器 中煮 沸后 ，用 1N的盐 酸或1N氢氧 化钠 调制 PH6.7，分 装于 250ml三角 瓶内 （每 瓶装 150ml）， 115 、 0.075MPa灭菌 30min后备 用。 3.1.3菌种 纯化 方法将实 验室 分离 培养 得到 的冬 虫夏 草真 菌，经 显 微镜 检查 确认 为中 国被 毛孢 后，将 该 菌落 边缘 挑取 少 量菌 丝体 ， 接 种 在纯 化用 固体 培养 基上 ， 10 15 条件 下培 养。 待 菌 丝长 满斜 面后 ， 再 接 种到 纯化 用液体 培养 基中 ， 在 10 15
8、 、 120r/min条件 下， 每 天 10小时 连续 进行 震荡 培养 ， 待 震 荡培 养至 液体 中长出 菌丝 球后 ，再 次转 接到 固体 培养 基中 。反 复移 植 2次 3次， 即达 到菌 种纯 化。4菌种 保存 方法4.1试管 继代 保存 法（ 斜面 低温 保藏 法） 4.1.1将长 满菌 丝的 斜面 培养 基，置 4 6 下保 存， 保持 温度 稳定 ，每 5个月 6个月 传代 一次 。此方 法最 多只 能传代 3次 4次， 4代后 就失 去了 活力 。4.1.2随时 观察 保藏 菌株 的活 力和 纯度 ，一 旦染 杂， 进行 剔除 。4.2试管 石蜡 液体 保存4.2.1液
9、体 石蜡 保藏 法： 将化 学纯 液体 石蜡经 121 、 0.1MPa灭菌 30min后， 无菌 注入 试管 斜面 培养物上 ,使液 面高 出试 管斜面 1cm,试管 口塞 上胶 塞或 棉塞 ,4 冰箱 保藏 。使 用时 ,倒去 液体 石蜡 ,用无 菌 水洗 涤斜 面菌种 1次 2次 ,进行 接种 。4.2.2将菌 种移 殖到 液体 培养 基，置 5 8 条件 下保 存， 保持 温度 稳定 。此 方法 可保存 1.5年 2年。 4.3冷冻 真空 干燥 保存冷冻 真空 干燥 法的 主要 步骤 为：准 备 安瓿 管 制备 脱脂 牛奶 制备 菌液 分装 菌液 预冻 真空 干燥 封管 。 -70 冰
10、箱 保存 ，时 间可 达 1年。 4.4菌种 保存 用培 养基4.4.1土豆 汁的 制备取去 皮土 豆 500g，水 1000ml，切 片煮 沸 1h，定 容至 1000ml，取 上清 液备 用。4.4.2固体 培养 基制 备取土 豆汁 上清 液 1000ml， 分 别 加入 蛋白 胨 1%、 葡 萄 糖 1%、 酵 母 浸膏 0.1%、 磷 酸 氢二 钾 0.1%、 硫 酸 镁0.02%、琼 脂 1.8% 2%。煮 沸溶 化， 用 1N的盐 酸或 1N氢氧 化钠 调制 PH6.7，后 分装 于试 管内 （中 试管 每 支约 6ml 7ml） 115 、 0.075MPa灭菌 30min后取
11、出， 摆成 斜面 备用 。4.4.3液体 培养 基制 备 DB63/T863 2009 3 取土 豆汁 上清 液 1000ml， 分 别 加入 蛋白 胨 1%、 葡 萄 糖 1%、 酵 母 浸膏 0.1%、 磷 酸 氢二 钾 0.1%、 硫 酸 镁0.02%， 煮 沸 溶化 ， 用 1N的盐 酸或 1N氢氧 化钠 调制 PH6.7， 后 分 装于 250ml三角 瓶内 （ 每 瓶装 150ml） 。115 、 0.075MPa灭菌 30min后取 出备 用。4.5冬虫 夏草 真菌 的保 存步 骤4.5.1准备 工作4.5.2升汞 消毒 液的 配制 准确 称取 0.1gHgCl2加少 许蒸 馏水
12、 溶解 后用 蒸馏 水定 容至 100ml。4.5.3消毒 灭菌4.5.3.1分菌 工作 前用 有效 氯含 量为 1. 1.3的 消毒 液将 分菌 环境 喷雾 消毒 。4.5.3.2将分 菌用 的医 用手 术刀 、医 用小 剪刀 、接 种铲 、接 种针 、 9cm培养 皿用 柔性 较好 的纸 张包扎好 后， 至于 121 、 0.1MPa条件 下灭菌 30min后取 出， 放入 超净 工作 台内 备用 。4.5.3.3将已 制备 灭菌 好的 培养 基试 管放 入超 净工 作台 内， 打 开超 净工 作台 内的 紫外 灯， 照射 30min 后关 闭紫 外灯 的电 源。 5菌种 转移5.1固体
13、培养 基转 移按照无菌操作的要求，将纯化好的固体培养基上的菌种，挑取少量菌丝接种在保存用斜面培养基内， 用无 菌胶 塞封 口， 10 15 条件 下培 养。 5.2液体 培养 基转 移按照 无菌 操作 的要 求， 用 10ml的无 菌吸 管吸 取三 角瓶 内纯 化好 的菌 丝球 ，接 种在 保存 用液 体培 养基内 ，用 胶塞 加石 蜡封 试管 口， 作为 保存 菌种 备用 。 6保存 菌种 的复 壮 需要 使用 菌种 ，复 活培 养时 ，需 在无 菌条 件下 打开 保存 的试 管， 取部 分菌 种于 4.4.2的斜 面培 养基 上， 长出 菌落 后再 转接 一次 ，或 者接 种到 4.4.3的液 体培 养基 中， 增殖 培养 后再 转接 斜面 。进 行显 微镜检查 ，镜 检方 法见 实 验室 冬虫 夏草 真菌 中国 被毛 孢分 离技 术规 程 。
