1、ICS备 案号 ： 2502-09青 海 省 地 方 标 准 DB63 DB63/T76209牛出血性败血症诊断技术规范 209-03-0发布 209-04-30实施青 海 省 质 量 技 术 监 督 局发布发布发布发布 DB63/T76209 I 目 次前 言 .I1范 围 .12规 范性 引用 文件 .1 3术 语 .14临 床诊 断 .15病 理剖 检 .26病 原分 离和 鉴定 .27血 清学 试验 .28诊 断判 定 .3 附 录 A（ 规范 性附 录） 培 养基 制备 .4A.1血 液琼 脂 .4.2CSY琼 脂 .4A.3麦 康凯 琼脂 培养 基 .4.4糖 发酵 培养 基制 备
2、 .5A.51%蛋 白胨 水 .5 .6靛 基质 试剂 .5A.7氧 化酶 试剂 的配 制 .5附 录 B（ 规范 性附 录） 抗 原和 红细 胞制 备 .6B.1荚 膜抗 原的 制备 .6.2新 鲜红 细胞 的制 备 .6B.3致 敏红 细胞 的制 备 .6 .4菌 体抗 原制 备 .6 DB63/T76209 I 前 言牛 出血 性败 血症 又称 牛 巴氏 杆菌 病 ， 是 牛的 一种 急性 热性 传染 病 ， 其 发病 率和 死亡 率很 高 ， 本 菌主要 以荚 膜抗 原和 菌体 抗原 区分 血清 型， 牛 巴氏 杆菌 以 6:B为 主， 对 养牛 业危 害严 重， 我国 列为 二类 动
3、物 疫 病 。 牛 出血 性败 血症 在我 省农 牧区 广泛 流行 ， 严 重危 害养 牛业 发展 ， 为 规范 青海 省牛 出血 性败 血症 诊断 技术 ，根 据 OIE有 关多 杀性 巴氏 杆菌 病诊 断技 术规 定和 国内 通用 方法 ，结 合青 海省 实际 情况 ，制 定本标 准。 本 规 范 按 GB/T1. 20 标准 的结 构和 编写 规则 进 行编 制。本 规 范的 附录 A和 附录 B为 规范 性附 录。本 规 范 由 青海 省农 牧厅 提出 并 归口 。 本 规 范 由 青海 省质 量技 术监 督局 批准 。本 规 范 由 青海 省 动 物疫 病预 防控 制中 心 负 责起
4、 草。本 规范 主要 起草 人： 蔡 金山 、沈 艳丽 、马 睿麟 、赵 全邦 、张 茂华 、李 桂兰 、王 晓润 。 DB63/T76209 1 牛出血性败血症诊断技术规范1范 围 本 规范 规定 了牛 出血 性败 血症 的诊 断技 术要 求 本 规范 适用 于牛 出血 性败 血症 的诊 断2规 范性 引用 文件 下 列文 件中 的条 款通 过本 规范 的引 用而 成为 本规 范的 条款 。 凡 是注 日期 的引 用文 件 ， 其 随后 所有 的修 改单 （ 不 包括 勘误 的内 容 ） 或 修订 版均 不适 用于 本规 范 ， 然 而 ， 鼓 励根 据本 规范 达成 协议 的各 方研 究
5、是 否可 使用 这些 文件 的最 新版 本。 凡是 不注 日期 的引 用文 件， 其最 新版 本适 用于 本规 范。 GB4789.28-203食 品卫 生微 生物 学检 验染 色法 、培 养基 和试 剂NY/T563 202禽 霍乱 诊断 技术NY/T564 202猪 巴氏 杆菌 病诊 断技 术NY/T567 202兔 出血 性败 血症 诊断 技术 3术 语3.1临 床诊 断 通 过 临 床观 察和 检查 对病 例的 病性 和病 情做 出判 断。3.2 病 理检 查 对 动物 （尸 ）体 进行 解剖 检查 和组 织学 检查 ，以 发现 其病 理学 变化 ，作 为疾 病诊 断的 依据 之一 。
6、3.实 验室 诊断 采 取病 料， 进行 病原 培养 、动 物试 验， 做出 诊断 结果 。3.4 病 原分 离 通 过相 应试 验操 作程 序， 从样 品中 取得 致病 性生 物的 纯培 养物 。3.5病 原鉴 定 通 过试 验对 病原 分离 物定 性。3.6 血 清学 试验 借 助抗 体在 体外 （与 抗原 ）的 血 清学 反应 进 行的 各种 检查 。3.7凝 集试 验 颗 粒性 抗原 （ 细 菌 、 红 细胞 等 ） 与 对应 抗体 （ 或 其他 外源 性凝 聚素 ） 在 电解 质参 与下 ， 结 成可 见的凝 块， 以此 进行 血清 学检 测。 4临 床诊 断 DB63/T76209
7、 2 4.1败 血型病 初 体 温可 高达 41 42 ， 出 现全 身症 状， 呼 吸 困 难 、 心 跳 10次 以上 、食 欲废 绝、 反刍 停止 ，稍 经时 日， 患牛 表现 腹疼 ，开 始下 痢， 拉稀 开始 后， 体温 随之 下降 ，迅 速死 亡。 4.2浮 肿型 （水 肿型 ）体 温 41 ， 在 颈 部 、 咽 喉部 及 胸 前 的 皮下 结蹄 组织 出 现水 肿 ， 同时 伴发 舌及 周围 组织 的高 度肿 胀 ，出 现 吞 咽、 呼吸 困难 ， 皮 肤和 粘膜 普遍 发绀 ， 重 者窒 息而 死。 牦 牛多 见。 4.3肺 炎型主 要表 现纤 维素 性胸 膜肺 炎症 状。
8、病 畜便 秘， 有 黏液 和血 块的 粪便 。 黄 牛多 见。5病 理剖 检5.1败 血型呈 全身 性急 性败 血症 变化 。 内 脏器 官出 血 ， 在 粘膜 、 浆 膜以 及肺 、 舌 、 皮 下组 织和 肌肉 都有 出血 点 ； 肝 脏和 肾脏 实质 变性 ；淋 巴结 显著 水肿 ；胸 腹腔 内有 大量 渗出 液。 5.2浮 肿型咽 喉部 或颈 部皮 下有 浆液 浸润 ， 切 开水 肿部 流出 深黄 色液 体 ， 有 时伴 有出 血 ； 咽 周围 组织 和会 咽软骨 韧带 呈黄 色胶 样浸 润， 咽淋 巴结 和颈 前淋 巴结 高度 肿胀 。 5.3肺 炎型主 要表 现纤 维素 性肺 炎和
9、 浆液 纤维 素 性 胸膜 炎 。 胸 腔积 有浆 液性 纤 维 素 性液 体 ， 肺 组织 切面 呈大 理 石 状 。 有 时有 纤维 素性 心包 炎和 腹膜 炎， 心 包及 胸 膜 上 见 到结 缔组 织 增 生形 成的 纤维 素膜 。6病 原分 离和 鉴定6.1培 养基 及试 剂所 需培 养基 及试 剂有 血液 琼脂 、 CSY琼 脂、 麦康 凯琼 脂、 糖发 酵培 养基 、靛 基质 试剂 、氧 化酶 试剂等 ，配 制方 法见 附录 A。 6.2病 原分 离濒 死前 或死 后数 小时 内采 集病 死牛 的心 血、 肝、 脾等 组织 样品 划线 接种 于血 液琼 脂、 麦康 凯和 CSY琼
10、 脂， 置 36 37 培 养。6.3病 原鉴 定6.31病 原形 态取 病死 牛肝 、脾 组织 或血 液抹 片 ， 瑞氏 染色 镜检 发现 大量 两端 浓染 的短 杆菌 ；革 兰氏 染色 镜检 ， 呈 单 个散 在的 革兰 氏阴 性小 杆菌 。 6.32培 养特 性在 血琼 脂上 形成 不溶 血 、 光 滑的 、 有 灰色 光泽 的半 透明 菌落 ， 直 径约 1m。 在 CSY琼 脂培 养基 上菌 落较 大。 在麦 康凯 琼脂 培养 基上 不生 长。 6.3生 化鉴 定6.3.1糖 发酵 试验 将 CSY肉 汤 6h 8h培 养物 ,接 种到 血液 琼脂 培养 基上 ,培 养过 夜 (18
11、h 20h)， 用 1%的 蛋白 胨水 将培 养物 洗下 ， 接 种糖 发酵 管 ， 36 37 培 养 ， 本 菌应 发酵 葡萄 糖 、 蔗 糖 ， 产 酸 ， 不 发酵 乳糖 和水 杨苷 、鼠 李糖 。 6.3.2靛 基质 试验用 1%蛋 白胨 培养 基的 48小 时培 养物 加入 靛基 质试 剂 0.5mL， 沿管 壁流 下， 覆盖 于培 养液 表面 ，液 面接 触处 呈玫 瑰红 色， 为阳 性反 应。 6.3.3氧 化酶 试验取 白色 洁净 滤纸 沾取 菌落 ，加 试剂 一滴 ，阳 性者 呈粉 红色 ，并 逐渐 加深 。 DB63/T76209 3 6.4动 物接 种试 验4%血 清肉
12、 汤 24h培 养物 经稀 释后 ， 每 只小 鼠皮 下接 种 0.2mL， 接 种动 物在 24h 72h内 死亡 ， 并 可从 肝 、脾 及心 血中 分离 到多 杀性 巴氏 杆菌 。 7血 清学 试验7.1间 接血 凝试 验（ 荚膜 分型 ） 7.1材 料血 凝板 ，荚 膜抗 原、 新鲜 红细 胞、 致敏 红细 胞等 其配 制方 法见 附录 B.1、 B.2、 B.3。7.12操 作方 法7.12.1加 稀释 液每 排的 第 1孔 加 0.72mL生 理盐 水， 后面 的 6孔 各加 入 0.4mL生 理盐 水。7.12.抗 血清 稀释 每 排的 第 1孔 加入 0.8mL血 清， 混匀
13、，从 该孔 取出 0.4mL移 入第 2孔 ，混 匀后 取出 0.4mL移 入第 3孔 。依 次类 推， 直至 第 7孔 混匀 后取 出 0.4mL丢 弃。 则第 1孔 1： 10稀 释， 以后 每孔 倍比 稀释 。7.12.3加 致敏 红细 胞每 孔加 入 0.4mL致 敏红 细胞 ，轻 微震 荡， 置于 室温 下 1.5h 2h判 定结 果。 每个 试验 均设 阳性 、阴 性和 盐水 对照 。 7.12.4结 果判 定 红 细胞 的 散 状 凝 集 （ 血球 悬浮 于孔 内） 为 阳性 结果 ， 出 现小 钮扣 状 红 细胞 沉积 为阴 性反 应。7.2凝 集试 验（ 菌体 分型 ）7.2
14、1材 料菌 体抗 原， 试剂 配制 方法 见附 录 B.47.2操 作方 法7.2.1抗 血清 是用 抗参 考菌 株 6:B全 菌体 悬液 制得 的。 7.2.2取 一滴 待 检抗 原 涂 于 玻 片上 ， 然后 用 一 滴生 理盐 水混 合， 加一 滴抗 血 清 ， 并缓 慢加 热玻 片，出 现细 的颗 粒状 凝集 时 ,即 为特 异性 的菌 体凝 集 。8诊 断判 定 依 据临 床症 状和 病理 变化 可作 初步 诊断 ， 确 切诊 断需 进行 病原 分离 培养 特性 、 生 化鉴 定 、 动 物接 种试 验。 血清 学定 型试 验可 作为 选作 项目 ，可 根据 实验 室具 体条 件选
15、择开 展。 DB63/T76209 4 附 录 A（ 规范 性附 录） 培 养基 制备A.1血 液琼 脂 A.1成 分牛 肉膏 5g蛋 白胨 10g葡 萄糖 5g氯 化钠 5g磷 酸氢 二钾 1g 琼 脂 20g蒸 馏水 10mLA.12制 法将 PH值 调为 7.4 7.6后 ,12 高 压灭 菌 20min,将 普通 琼脂 凉至 50 左 右 ， 按 5% 10%量 加入 无菌抗 凝血 液， 混匀 后倾 注于 平皿 。 A.2CSY琼 脂A.21成 分水 解酪 蛋白 3g蔗 糖 3g酵 母浸 膏 5g 氯 化钠 5g无 水硫 酸氢 二钾 3g蒸 馏水 10mLA.2制 法将 PH值 调 为
16、 7.3 7.4后 ,高 压 灭 菌 15min,加 入 无 菌 琼 脂 ,使 其 终 末 浓 度 为 1.5%。 待 冷 却 到 45 50 时 ,加 5%犊 牛血 液 (无 多杀 性巴 氏杆 菌抗 体 )。 A.3麦 康凯 琼脂 培养 基A.31成 分蛋 白胨 17g胨 3g猪 胆盐 （或 牛、 羊胆 盐） 5g 氯 化钠 5g琼 脂 17g蒸 馏水 （或 去离 子水 ） 10mL乳 糖 10g0.1%结 晶紫 水溶 液 10mL0.5%中 性红 水溶 液 5mL A.32制 法 DB63/T76209 5 A.32.1将 蛋白 胨 、 胨 、 胆 盐和 氯化 钠溶 解于 40mL蒸 馏水
17、 中 ， 校 正 PH值 为 7.2。 将 琼脂 加入 60mL蒸 馏水 中， 加热 溶解 。将 液体 合并 ，分 装于 烧瓶 内， 12 高 压灭 菌 15min， 备用 。A.32.临 用时 加热 融化 琼脂 ，趁 热加 乳糖 ，冷 至 50 5 时 ，加 入结 晶紫 和中 性红 水溶 液， 摇匀后 倾注 平板 。 A.4糖 发酵 培养 基制 备 A.41材 料A.41.小 试管 （内 装有 倒置 小管 ）灭 菌后 备用A.41.2糖 、醇 等（ 分析 纯）A.41.3指 示剂 ： 1.6%的 溴甲 酚紫 。A.41.41%蛋 白胨 水A.42制 法 每 种糖 （ 醇 ） 按 质量 浓度
18、为 1%比 例分 别加 入到 装有 1%蛋 白胨 水的 瓶中 ， 加 热溶 解后 ， 按 0.1%的 比例加 入 1.6%的 溴甲 酚紫 指示 剂 ， 摇 匀后 ， 分 装小 试管 ， 每 支大 约 6mL， 流 通蒸 汽灭 菌 3次 ， 每 天 1次 ， 每 次30min。A.51%蛋 白胨 水蛋 白胨 10g 氯 化钠 （ NaCI） 5g蒸 馏水 10mL将 以上 材料 混合 ，加 热溶 解， 调整 PH7.4。 煮沸 滤过 ，分 装于 中性 容器 中， 103.7kpa灭 菌 20min。A.6靛 基质 试剂对 二甲 氨基 苯甲 醛 1g 95%乙 醇 95mL浓 盐酸 20mL将 对
19、二 甲基 氨苯 甲醇 溶于 乙醇 中， 然后 慢慢 加进 盐酸 。此 试剂 应如 量配 制， 并保 存冰 箱内 。A.7氧 化酶 试剂 的配 制盐 酸二 甲基 对苯 二胺 溶液 1g 去 离子 水 10mL将 1g盐 酸二 甲基 对苯 二胺 溶液 溶于 10mL的 去离 子水 中 DB63/T76209 6 附 录 B（ 规范 性附 录）抗 原和 红细 胞制 备B.1荚 膜抗 原的 制备 将 参考 菌株 6:B的 6h 8h肉 汤培 养物 ,接 种到 CSY琼 脂 板上 ,37 培 养过 夜。 用含 0.3%福 尔马 林的 3毫 升生 理盐 水将 生长 物洗 下。 然后 在 56 加 热 30
20、min,在 4 以 30转 离 心 15min,上 清液 保存 在 -20 。 如果 不能 冷冻 离心 ,则 以 150转 离 心 30min,上 清液 即 为荚 膜 抗 原。B.2新 鲜红 细胞 的制 备无 菌采 集绵 羊血 液 ,加 入抗 凝剂 ,以 50转 离 心 10min。 沉淀 的红 细胞 用无 菌生 理盐 水洗 3次 。 B.3致 敏红 细胞 的制 备取 荚膜 抗原 3mL， 加 入 0.2mL洗 净的 红细 胞 ， 在 37 振 荡致 敏 1h,离 心收 集致 敏的 红细 胞 。 再 用无菌 生理 盐水 洗 3次 ,最 后用 生理 盐水 配成 1%悬 液 。B.4菌 体抗 原制
21、 备 将 6h 8h的 待检 培养 物接 种到 CSY培 养基 上 ,培 养过 夜 。 每 块板 用 2mL 3mL0.3%福 尔马 林生 理盐水 将 生 长 物 洗 下 混 合 后 ,在 4 以 30转 离 心 15min(120转 150转 在 室 温 离 心 30min 45min),沉 积的 细菌 用 25毫 升盐 酸生 理盐 水重 悬到 布朗 氏比 浊管 第 6管 的浊 度 ,再 培养 过夜 。 悬 液再 离心 ,上 清液 弃去 ,沉 淀细 菌分 别用 PH依 此 为 5.0、 6.0及 7.0的 磷酸 缓冲 盐水 连续 洗涤 。 最 后用 PH7.0的 磷酸 缓冲盐 水将 沉淀 的菌 体悬 浮到 相当 于布 朗氏 比浊 管第 6管 的浊 度。
