1、ICS备 案号 ： 2504-209青 海 省 地 方 标 准 DB63 DB63/T78209羊梭菌性疾病诊断技术规范 209-03-0发布 209-04-30实施青 海 省 质 量 技 术 监 督 局发布发布发布发布 DB63/T78209 I 目 次前 言 .I1范 围 .12规 范性 引用 文件 .1 3术 语 .14临 床诊 断 .15病 理剖 检 .26病 原分 离和 鉴定 .2附 录 A（ 规范 性附 录） 培 养基 制备 .5A.1血 液琼 脂 .5 .2厌 氧肉 肝汤 配制 .5A.3牛 乳培 养基 .5.4肉 肝胃 酶消 化液 培养 基 .5 DB63/T78209 I 前
2、 言羊 梭菌 性疾 病 是 由梭 状芽 胞杆 菌属 中的 病 原 微 生物 所 引 起 的 一类 急 性传 染病 。 包 括羊 快疫 、 羊 肠毒血 症 、 羊 猝疽 、 羊 黑疫 和羔 羊痢 疾 ， 是 羊的 一种 重要 传染 病 ， 其 发病 率和 死亡 率较 高 ， 严 重影 响着 养羊 业 发展 。 为 规范 羊梭 菌性 疾病 诊断 技术 ， 有 效控 制羊 梭菌 性疾 病的 发生 和流 行 ， 依 据 中 华人 民共 和国动 物防 疫法 、 青 海省 实施 中华 人民 共和 国动 物防 疫法 的有 关规 定， 结合 青海 省实 际情 况 ， 特制 定本 规范 。 本 规 范 按 GB
3、/T1. 20 标准 的结 构和 编写 规则 进 行编 制。本 规 范的 附录 A为 规范 性附 录。本 规 范 由 青海 省农 牧厅 提出 并 归口 。 本 规 范 由 青海 省质 量技 术监 督局 批准 。本 规 范 由 青海 省 动 物疫 病预 防控 制中 心 负 责起 草。本 规范 主要 起草 人： 沈艳 丽、 马睿 麟、 蔡金 山、 王晓 润、 邢建 民、 张茂 华、 都占 林。 DB63/T78209 1 羊梭菌性疾病诊断技术规范1范 围 本 规范 规定 了羊 梭菌 性疾 病的 诊断 技术 要求 本 规范 适用 于羊 梭菌 性疾 病的 诊断2规 范性 引用 文件 下 列文 件中 的
4、条 款通 过本 标准 的引 用而 成为 本标 准的 条款 。 凡 是注 日期 的引 用文 件 ， 其 随后 所有 的修 改单 （ 不 包括 勘误 的内 容 ） 或 修订 版均 不适 用于 本标 准 ， 然 而 ， 鼓 励根 据本 标准 达成 协议 的各 方研 究是 否可 使用 这些 文件 的最 新版 本。 凡是 不注 日期 的引 用文 件， 其最 新版 本适 用于 本标 准。 GB4789.13食 品卫 生微 生物 学检 验产 气荚 膜梭 菌检 验GB4789.28食 品卫 生微 生物 学检 验染 色法 、培 养基 和试 剂GB/T18635动 物防 疫 基 本术 语3术 语3.1 临 床诊
5、断 通 过 临 床 观 察和 检查 对病 例的 病性 和病 情做 出判 断。3.2病 理检 查 对 动物 （尸 ）体 进行 解剖 检查 和组 织学 检查 ，以 发现 其病 理学 变化 ，作 为疾 病诊 断的 依据 之一 。3. 实 验室 诊断 采 取病 料， 进行 病原 培养 、动 物试 验， 做出 诊断 结果 。3.4病 原分 离 通 过相 应试 验操 作程 序， 从样 品中 取得 致病 性生 物的 纯培 养物 。3.5 病 原鉴 定 通 过试 验对 病原 分离 物定 性。3.6中 和试 验 抗 体与 抗原 结合 后可 使病 原体 失去 感染 性或 使外 毒素 失去 毒性 ， 并 表现 为对
6、 细胞 或动 物的 免疫 保护作 用。 4临 床诊 断4.1羊 快疫 ：患 羊常 无临 诊症 状即 突然 死亡 。病 程稍 缓者 ,表 现为 不愿 行走 ,运 动失 调 ,腹 痛、 腹泻 ,磨牙 抽搐 ,最 后衰 弱昏 迷 ,口 流带 血泡 沫 ,多 于数 分钟 或几 小时 内死 亡 ,病 程极 为短 促。4.2羊 肠毒 血症 ： 发 病突 然 ,病 羊呈 腹痛 、 肚 胀症 状 。 患 病羊 常离 群呆 立 、 卧 地不 起或 独自 奔跑 。 濒 死期 发生 肠鸣 或腹 泻 ,排 出黄 褐色 水样 稀粪 ，病 羊全 身颤 抖 ,磨 牙后 仰 ,口 鼻流 沫 ,于 昏迷 中死 去。 DB63/
7、T78209 2 4.3羊 猝狙 ：与 羊快 疫、 羊肠 毒血 症极 为相 似， 病程 短促 ,常 未见 出现 临床 症状 ,突 然死 亡。 病羊 表现掉 群 ,卧 地 ,烦 躁不 安 ,机 体衰 弱， 全身 痉挛 ,在 数小 时内 死亡 。4.羔 羊痢 疾 ： 多 发生 于 2 10日 龄羔 羊 ， 以 拉稀 为主 要特 征 。 病 初精 神萎 顿 ， 低 头拱 背 ， 不 愿吃 奶 ，不 久就 发生 腹泻 ，粪 便恶 臭， 直至 成为 血便 ，常 在 1d 2d内 死亡 。4.5羊 黑疫 ： 病 程短 促 ,大 多数 发病 羊只 表现 为突 然死 亡 。 部 分病 例可 拖延 1d 2d。
8、 常 表现 食欲 废绝 ,反 刍停 止 ,精 神不 振 ,放 牧掉 群 ,呼 吸急 促 ,体 温 41.5 左 右 ,昏 睡俯 卧而 死 。 主 要发 生于 春夏 季节 、 肝 片 吸 虫感 染的 低洼 地， 发病 羊多 为 1岁 以上 肥胖 羊。5病 理剖 检5.1羊 快疫 ：剖 检多 见死 羊尸 体迅 速腐 败膨 胀。 可视 粘膜 充血 呈暗 紫色 。体 腔多 有积 液。 特征 性表 现为 真胃 出血 性炎 症 ,胃 底部 及幽 门部 粘膜 可见 大小 不等 的出 血斑 点及 坏死 区 ,粘 膜下 发生 水肿 。 肠 道内 充满 气体 ,常 有充 血、 出血 、坏 死和 溃疡 。心 内、
9、外膜 可见 点状 出血 。胆 囊多 肿胀 。 5.2羊 肠毒 血症 ：胃 肠变 化同 羊快 疫， 其主 要特 征为 肾肿 大、 实质 变软 ，严 重时 肾脏 软化 如泥 样， 又称 软肾 病 。5.3羊 猝狙 ： 与 羊快 疫 、 羊 肠毒 血症 极为 相似 ， 剖 检可 见小 肠严 重出 血糜 烂 ,体 腔内 多有 积液 ， 浆 膜上小 点出 血 ,肌 肉出 血有 气性 裂孔 。5.4羔 羊痢 疾 ： 真胃 内有 未消 化的 凝乳 块， 小肠 粘膜 充血 出血 ，病 程长 者可 见直 径 1m 2m的 溃疡 ，肠 系膜 淋巴 结肿 胀充 血。 5.羊 黑疫 ： 剖 检可 见尸 体皮 下静 脉
10、显 著淤 血 ,皮 肤呈 暗黑 色外 观 。 真 胃幽 门部 、 小 肠粘 膜充 血 、 出 血 。肝 脏充 血 、 肿 胀 ， 表 面和 深层 有数 目不 等的 灰黑 色凝 固性 坏死 灶 ,界 限清 晰 ， 周 围有 一鲜 红色 充血 带围绕 ，坏 死灶 切面 呈半 圆形 。 6病 原分 离和 鉴定6.1羊 快疫 6.1形 态与 染色病 原为 腐败 梭菌 ，革 兰氏 染色 阳性 的厌 氧大 杆菌 ，能 产生 芽胞 ，不 形成 荚膜 ，用 肝脏 被膜 做触 片 ，呈 无关 节长 丝状 。 6.12分 离培 养将 样品 划线 接种 于血 液琼 脂平 皿， 置厌 氧环 境中 培养 长成 薄纱 状
11、， 菌落 直径 2m 4m， 稍隆 起 ， 灰色 ， 边 缘不 整齐 ， 菌 落外 有狭 窄的 溶血 区 ， 在 深层 马丁 琼脂 平板 内形 成致 密的 小绒 球状 菌落 。 血 液琼 脂 培 养基 配制 方法 见附 录 A.1,马 丁琼 脂 按 GB4789.28第 4.75条 规定 配制 。6.13生 化试 验6.13.1对 葡萄 糖、 麦芽 糖、 乳糖 、果 糖及 水杨 苷产 酸产 气， 对蔗 糖、 木糖 、甘 露醇 均不 产酸 。糖 发酵 管按 GB4789.28第 3.2条 规定 配制 。6.13.2能 产生 硫化 氢， 还原 硝酸 盐和 液化 明胶 。培 养基 分别 按 GB47
12、89.28第 3.14条 、第 3.17条 、第 3.10条 规定 配制 。 6.14动 物接 种试 验用 24小 时培 养的 厌氧 肉肝 汤菌 液 0.5mL肌 肉注 射豚 鼠， 12h 36h死 亡。 死亡 动物 有菌 血症 ，可 从心血 分 离 出 细 菌 。 厌 氧 肉 肝 汤 配 制 见 A.2。 对 小 鼠 的 最 小 致 死 量 一 般 为 0.1-0.025mL， 对 豚 鼠 为0.2-0.025mL。6.2羊 猝狙 、肠 毒血 症、 羔羊 痢疾病 原体 分别 为 C型 、 D型 和 B型 产气 荚膜 梭菌 。 6.21形 态与 染色革 兰氏 染色 阳性 粗大 两端 钝圆 的杆
13、 菌 ， 无 鞭毛 、 不 运动 ， 在 动物 体内 能形 成荚 膜 ， 芽 胞位 于菌 体中 DB63/T78209 3 央 。 6.2分 离培 养病 料 （ 检 测 到 肠 毒 素 的 肠 段 ） 接 种 于 绵 羊 血 琼 脂 平 板 上 ， 置 厌 氧 环 境 中 培 养 24h 48h可 形 成 直 径1m 3m、 圆形 、边 缘整 齐、 灰色 至灰 黄色 、表 面光 滑半 透明 的菌 落， 大多 数菌 株可 产生 双环 溶血 ， 外围 是由 毒 素产 生的 不完 全溶 血环 。6.23生 化鉴 定 6.23.1接 种于 牛乳 培养 基 8h 10h后 ，分 解牛 乳中 的乳 糖，
14、使牛 乳酸 凝固 ，同 时产 生大 量气 体使 凝块 破裂 成多 孔海 绵状 ， 严 重时 被冲 成数 段 ， 甚 至喷 出管 外 ， 即 “ 爆 性发 酵 ” 。 牛 乳培 养基 配制 方法 见附录 A.36.23.2本 菌能 分解 葡萄 糖、 麦芽 糖、 乳糖 、半 乳糖 及果 糖， 产酸 产气 ，不 分解 甘露 醇及 水杨 苷。 糖发 酵管 按 GB4789.28第 3.2条 规定 配制 。6.23.能 产生 硫化 氢， 还原 硝酸 盐。 培养 基分 别按 GB4789.28第 3.14条 、第 3.17条 规定 配制 。 6.24动 物接 种试 验6.24.1毒 素测 定 ： 取 回肠
15、 内容 物 1份 ， 加 生理 盐水 1倍 4倍 ， 充 分混 合后 ， 以 每分 钟 30转 速度离 心 30分 钟 ， 然 后静 脉注 射家 兔 （ 2mL 4mL） 或 小白 鼠静 脉注 射 （ 0.2mL 0.4mL） ， 如 引起 急性 死亡 ，证 明肠 内容 物含 有毒 素。 把 分离 纯净 的细 菌接 种于 厌气 肉肝 汤中 ， 37 培 养 3天 后 ， 离 心取 上清 液 0.2mL给 小白 鼠静 脉注 射测定 最小 致死 量后 ， 作 中和 试验 ； 另 外取 上清 液 1mL， 加 含有 0.25%胰 酶的 1%碳 酸钠 溶液 1mL， 37 活 化 40 分 钟后 ，再
16、 进行 测毒 ，如 有死 亡， 说明 有毒 素存 在， 可用 D型 及 C型 血清 作中 和试 验， 以判 型别 。6.24.2毒 素定 型： 将肠 内容 物作 倍比 稀释 后， 把各 稀释 度肠 内容 物分 别静 脉注 射小 白鼠 ，根 据小 白鼠 死亡 情况 ，测 定其 最小 致死 量。 然后 取定 型血 清 0.5mL 0.1mL,加 入 2 5个 最小 致死 量的 毒素 液 ，加 生理 盐水 使其 总量 达 0.2mL 0.3mL， 37 温 箱放 置 40min， 使 抗毒 素与 毒素 充分 作用 ， 全 量注 射小 白鼠 ，观 察 24h， 记录 生存 和死 亡， 按下 表判 定结
17、 果。 表 1魏 氏梭 菌中 和试 验各 种反 应结 果 6.3羊 黑疫 ：6.31形 态与 染色 ： 病 原为 B型 诺维 氏梭 菌 ， 是 革兰 氏阳 性大 杆菌 ， 形 成芽 孢 ， 不 产生 荚膜 ， 有 鞭毛 ，能 运动 ，用 肝脏 坏死 病灶 边缘 的组 织抹 片镜 检， 可看 到粗 大杆 菌。 6.32分 离培 养： 取死 羊实 质器 官， 尤其 是肝 脏上 的坏 死灶 接种 于加 有新 鲜生 肝块 的厌 气肉 肝汤 中 ，37 培 养 72小 时， 将产 生气 体， （该 菌在 厌气 肉肝 汤中 不生 长或 生长 极微 弱， 在加 有生 肝的 厌氧 肉肝汤 中生 长良 好并 产
18、气 ） 抹 片 、 染 色镜 检 ， 观 察形 态 。 如 有杂 菌 ， 可 加热 80 10min纯 化 。 纯 净的 培养 物 可 接种 于不 加生 肝块 的肉 肝胃 酶消 化液 培养 基中 ， 37 培 养 72小 时， 离心 取上 清液 注射 小白 鼠， 并测定 其致 死量 ，一 般为 20 100MLD/mL。 然后 ，取 其上 清液 与等 量的 B型 诺维 氏梭 菌血 清作 中和 试验 ，做 出最 后诊 断。 肉肝 胃酶 消化 液培 养基 配制 方法 见附 录 A.4。6.3动 物接 种试 验： 将病 理材 料混 悬液 肌肉 注射 豚鼠 ，每 只豚 鼠皮 下注 射 2mL， 于 1
19、d 3d内 死亡 ，死 后剖 检可 见注 射部 位有 出血 性水 肿， 腹部 皮下 组织 呈胶 样水 肿， 透明 无色 或玫 瑰色 ，厚 度有 时可 达1cm， 且可 向前 延伸 至颈 部。 该毒 素在 碱性 （ PH8.0） 环境 中可 被胰 酶破 坏。 结果混合 第一种结果 第二种结果 第三种结果 第四种结果B型血清肠内容物或培养物上清 活 肠 毒 素 是 C型 活 肠 毒素 是 D型 活 肠毒素是 B型或 E型 活 肠毒素是 A型C型血清肠内容物或培养物上清 活 死 死 活D型血清肠内容物或培养物上清 死 活 死 活 DB63/T78209 4 6.34毒 素检 查： 中 和试 验取 培
20、养 物上 清液 1ml与 1mlB型 诺维 氏梭 菌诊 断血 清混 合， 37 作 用 45min， 静脉 注射 小白 鼠， 同时设 对照 组。 如果 对照 组小 白鼠 死亡 （表 示被 检材 料含 有毒 素） ，试 验组 小白 鼠存 活（ 说明 毒素 可被 B型诺 维氏 梭菌 定型 血清 中和 ）， 即产 毒素 菌为 B型 诺维 氏梭 菌 DB63/T78209 5 附 录 A（ 规范 性附 录） 培 养基 制备A.1血 液琼 脂 A.1成 分牛 肉膏 5g蛋 白胨 10g氯 化钠 5g磷 酸氢 二钾 1g葡 萄糖 5g 琼 脂 20g蒸 馏水 10mLA.12制 法将 PH值 调为 7.4
21、 7.6后 ,12 高 压灭 菌 20min,将 普通 琼脂 凉至 50 左 右， 按 5% 10%量 加入 无菌 抗凝 或脱 纤血 液， 混匀 后倾 注于 平皿 。 A.2厌 氧肉 肝汤 配制A.21成 分牛 肉汤 （ 1:2） 50mL肝 汤（ 1:2） 50mL蛋 白胨 10g 氯 化钠 5g葡 萄糖 5gA.2制 法加 热溶 解， 将 PH值 调为 7.8 8.0,分 装于 中试 管中 ，上 加石 蜡油 ，下 加肝 块（ 取动 物新 鲜肝 脏 ， 经10 加 热 20min 30min使 蛋白 凝固 ， 取 出用 刀切 成 0.3cm左 右的 小块 ， 放 于试 管底 ， 加 入上 述
22、培 养基 6mL 8mL， 液面 盖以 石蜡 油） ， 15磅 高压 蒸气 灭菌 20min 30min。 A.3牛 乳培 养基A.31成 分脱 脂牛 乳 10mL1.6%溴 甲酚 酒精 溶液 0.1mL或 8%石 蕊的 40%乙 醇溶 液适 量A.32制 法 取 新鲜 牛乳 （也 可用 奶粉 配制 成 10%水 溶液 代替 ）， 加热 或离 心去 掉脂 肪。 将指 示剂 加入 脱脂 牛乳内 ，分 装于 小试 管中 ，以 15 高 压蒸 汽灭 菌 20min。A.4肉 肝胃 酶消 化液 培养 基A.41成 分消 化液 10mL 蛋 白胨 10g葡 萄糖 5g DB63/T78209 6 酵 母膏 5gA.42制 法取 新鲜 去筋 腱 、 去 脂肪 牛肉 20g， 新 鲜肝 脏 5g， 水 10mL， 盐 酸 12.5mL， 胃 蛋白 酶 (1:00)1.25g， 52 -54 消 化 20h， 滤清 。加 入上 述成 分溶 解后 ，用 1Na0H将 PH值 调为 7.8 8.0， 分装 于小 试管中 ，上 加石 蜡油 ，下 加肝 块， 15磅 高压 蒸气 灭菌 20min 30min。
