1、I CS 备案号： 15215-2004 青 海 省 地 方 标 准 DB6 3 / T 4 5 5 . 6 2 0 0 4 肉牛 繁殖技 术规程 T e c h n i c a l r e g u l a t i o n o n b e e f c a t t l e r e p r o d u c t i o n 2 0 0 4 - 0 2 - 1 7 发布 2 0 0 4 - 0 4 - 0 1 实施 青 海 省 质 量 技 术 监 督 局发布发布发布发布 DB63 DB63/T 455.6 2004 I 目 次 前言 . . . . . . . . . . . . . . . . .
2、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II 1 范围 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3、. . 1 2 规范性引用文件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 术语和定义 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4、. . . . . . . . . . . 1 4 肉牛发情鉴定方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 母牛繁殖性能 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5、. . . . . . . . . . . . . . . . . 1 6 繁殖性能指标 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 初产月龄 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 年繁殖率 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 9 人工授精技术管理 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 10 产科管理 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 11 繁殖记录及统计报表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 12 肉牛人工授精技术操作规程见附录 A 、附录 B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 附录 A （规范性附录） 牛人工授精技术操作规程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9、 . . . . . . . . . . . 1 附录 B （规范性附录） 牛胚胎移植技术规程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 DB63/T 455.6 2004 I I 前 言 本标准制订了青海省肉牛繁殖技术规程，对肉牛繁殖技术、选种选配技术进行了规范。 本标准的附录 A 、附录 B 为规范性附录。 本标准由青海省农牧厅提出。 本标准由青海省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：青海省畜牧兽医总站。 本标准主要起草人：逯来章、焦小
10、鹿、刘海珍、陈学文。 DB63/T 455.6 2004 1 肉牛繁殖技术规 程 1 范围 本标准规定了肉牛繁殖技术的术语和定义、配种方法、繁殖技术等。 本标准适用于肉牛品种 ( 系 ) 的繁殖生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。 凡 是注日期的引用文件， 其 随后所有 的 修改单 （ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然 而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研 究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB 4143 1984 牛冷冻精液 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 配
11、种 m a t i ng i nse m i n a t i on 根据杂交计划的要求 , 公畜与母畜交配或进行人工授精的技术。 3.2 人工授精 a r t i f i c i a l i nse m i nat i on 是用人工方法采取公牛的精液 , 并注入到发情母牛生殖道内 , 达到母牛受胎的一种技术。 3.3 同期发情 e s t r us s ynchroniza t i on 用激素制剂或其它药物对群体母畜进行处 理 , 人为地控制并调整它们的自然发情周期进 程 , 使分散 发情变为在一定时间内集中发情 , 并进行配种。 4 肉牛发情鉴定方法 4.1 发情鉴定方法 4.1.1 外
12、部观察法 试情法、 阴道检查法 、直肠检查法。 4.1.2 卵泡发育的触诊，包括休情期，卵泡出现期、卵泡发育期，卵泡成熟期、排卵期。以上四期交 替出现在休情期起初形成的黄体较软，直径小于 1cm， 10 天内长到约 2 2.5cm。若未孕可重复以上周 期。 4.1.3 休情期的第 6 7 天是现代胚胎移植的最佳期。 掌握黄体的软硬和大小变化规律 , 参考发情的观察记录 , 可准确判断输精时间。 5 母牛繁殖性能 5.1 理想的产犊间隔为 12 个月，包括 1 个月的泌乳期和 2 个月的干乳期。随后，又开始产犊和泌乳。 5.2 性周期根据母牛的表现分为四个时期： 5.2.1 发情前期，持续 1
13、2 天。 5.2.2 发情期，持续 14 15 小时。 5.2.3 发情后期或恢复期 持续 4 天。 DB63/T 455.6 2004 2 5.2.4 休情期，持续 14 15 天，是由发情后期到下期发情前期的间隔时期。 5.2.5 当母牛终止发情以后，卵子从卵巢排出来 , 称为排放 . 牛的排卵多在终止发情以后 12 小时内完 成。 6 繁殖性能指标 6.1 年总受胎率 6.1.1 指标 85% 6.1.2 计算公式 公式： 年受胎母牛头数 年总受胎率 100% （ 1 ） 年受配母牛头数 6.2 年情期受胎率 6.2.1 指标 50%。 6.2.2 计算公式与统计方法 公式： 年受胎母牛
14、头数年情期受胎率 100% （ 2 ） 年输精总情期数 6.3 年平均胎间距 6.3.1 指标 85% 8.2 计算公式与统计方法 公式： 年实繁母牛头数年繁殖率 100% （ 5 ） 年应繁母牛头数 9 人工授精技术管理 9.1 发情和发情鉴定 9.1.1 对逾 15 月龄未见初情的育成母牛，须进行母畜产科的营养学检查。 9.1.2 发情鉴定采用观察法， 每 天不少于 3 4 次， 主 要观察性欲， 黏液性状， 必 要时检查卵泡发育 情 况。 9.2 配种 DB63/T 455.6 2004 3 9.2.1 配种方法 9.2.1.1 人工授精 ： 按附录 A 执行。 9.2.1.2 胚胎移植
15、：按附录 B 执行。 9.3 妊娠和妊娠诊断 9.3.1 母牛输精后进行两次妊娠诊断，第一次在配后 2 3 个月，第二次在停奶前。 9.3.2 妊娠诊断采用直肠检查法、腹壁触诊法。超声诊断法等。 9.3.3 对妊娠母牛要加强饲养管理，做好保胎工作。 10 产科管理 10.1 分娩管理 10.1.1 分娩母牛在预产期前 15 天进产房， 产后 15 天左右出产房。 产 房每周消毒一次，产 床 （ 或产 间 ） 每天消毒一次，并经常跟更换垫草，防止生殖道感染。 10.1.2 母牛应以自然分娩为主，需要助产时严格按产科要求进行。 10.1.3 对产后母牛要加强饲养管理，促进母牛生殖机能恢复。 10.
16、1.4 异性双胎母犊不得留作种用。 10.2 产后监护 10.2.1 产后 6 小时，观察母牛产道有无损伤，发现损伤要及时处理。 10.2.2 产后 12 小时内，观察母牛努责状况。母牛努责强烈时，要注意子宫是否还有胎儿和有无子宫 脱征兆，发现子宫脱要及时处理。 10.2.3 产后 24 小时内观察胎衣排出情况，发现胎衣滞留应及时处理。 10.2.4 产后 7 天内观察恶露排出的量和性状，发现异常要及时处理。 10.2.5 产后 15 天左右观察恶露排净程度及黏液的洁净程度，发现异常要酌情处理。 10.2.6 产后 30 40 天通过直肠检查子宫复旧情况，发现子宫复旧不全要及时治疗。 10.3
17、 繁殖障碍牛的管理 10.3.1 对产后 60 天未发情的牛只、 发 情后 40 天以上不再发情的未配牛只、 妊 检发现的未孕牛只， 要 查明原因并时行诱导发情。 10.3.2 对受精两次以上未妊娠的牛只，要进行母畜产科检查，发现病症及时处理。 10.3.3 对产后半年以上的未妊娠牛只要组织会诊。 10.3.4 对早期胚胎死亡、 流产。 早 产的牛只， 要分析原因， 必要时进行流行病学调查。 对传染性流 产 采取相应的卫生、防疫措施。 11 繁殖记录及统计报表 11.1 建立繁殖记录制度 记录内容如下： 11.1.1 发情记录包括发情日期、开始时间、持续时间、性欲表现、阴道分泌物状况等。 11
18、.1.2 配种记录包括配种日期、 第几次配种、 与配公牛号、 输精时间、 输精量、 精子活率、 子宫和 阴 道状况、排卵时间等。 11.1.3 妊娠记录包括妊娠日期、结果、处理意见、预产期、停奶日期等。 11.1.4 流产记录包括胎次、 配种日期、 与配公牛、 不孕症史、 配种时子宫状况、 流产日 期、 妊娠 月 龄、流产类型、流产后子宫状况、处理措施、流产后第一次发情日期、第一次配种日期、配妊日期等。 11.1.5 产犊记录包括胎次、 与配公牛、产犊日期、 分娩情况 （顺产、接产、 助产、 ）、 胎儿情况（ 正 常胎儿、死胎、双胎、畸形）、胎衣情况、母牛健康 状况、犊牛性别、编号、体重等。
19、11.1.6 产后监护记录包括分娩日期、检查日期、检查内容、临床状况、处理方法、转归日期等。 记录必须真实，书写工整，定期分析，总结和妥善保管。 DB63/T 455.6 2004 4 11.2 建立繁殖月报、季报和年报制度。 12 肉牛人工授精技术操作规程见附录 A 、附录 B 。 DB63/T 455.6 2004 1 附 录 A （规范性附录） 牛人工授精技术操作规程 本规程适用于使用牛冷冻精液人工授精的输精站。 A.1 牛冷冻精液输精站的基本建设 A.1.1 人工授精操作室 A.1.1.1 精液处理室 面积可为 8 10m2 ，要求屋顶、墙壁、地面平整。室内放置有液氮罐贮存冷冻 精液，
20、并进行冷冻精液的解冻及精液品质检查。 A.1.1.2 直检、 输精室 面积为 30 40 m2 。 室内安置有 1 2 个六柱栏， 用于对母牛直肠检查进行 发 情鉴定、 妊 娠诊断和不孕症防治， 同 时亦用于母牛输精。 要 求室内光线充足， 地 面平整， 便 于清除粪 便 。 A.1.2 母牛系留场（棚）根据本站配种范围内的适繁母牛数来确定一定面积的场地，用于拴系来站检 查和配种的母牛。一般距种公牛拴系场应保持 20m以上距离，或用墙壁圈舍隔开。 A.2 器械和药物的准备 A.2.1 药液的配制 75%酒精及 75%酒精棉球； 1/3000新洁而灭溶液；生理盐水棉球。 A.2.2 解冻液的配制
21、 A.2.2.1 2.9%柠檬酸钠溶液。 A.2.2.2 葡柠溶液。葡萄糖 3.0g、柠檬酸钠 1.4ml，蒸馏水加至 100ml。 A.2.2.3 复方蔗柠溶液。 蔗 糖 1.15g， 柠 檬酸钠 1.7g， 磷 酸二氢钾 0.325g， 碳 酸氢钠 0.09g， 氨 苯磺胺 0. 3g，蒸馏水加至 100ml。 A.2.3 器械 10升液氮贮存罐 1 个； 3L液氮贮存罐 1 个， 10L的液氮运输罐 1 个，生物显微镜及显微镜保温 箱；恒温水浴箱；各式牛用输精器；手提式高压灭菌器。 A.2.4 器械的洗涤 人工授精用的器械在每次使用以后，特别是注射器，输精器内的残留精液均应彻 底洗刷干净
22、，并需保持洁净、干燥，存放于清洁的厨柜内。 A.2.5 器械消毒和冲洗 A.2.5.1 玻璃棒、金属镊子。搪瓷方盘需要 75%酒精棉球消毒。 A.2.5.2 解冻用小试管、解冻液、注射器、生理盐水棉球，毛巾、纱布需用高压蒸汽消毒。要求消毒 温度达到 115 维持 30分钟。 A.2.5.3 颗粒及安瓿型冷冻精液输精器需经高压蒸汽消毒。当连续为数头母牛输精时，每输精一头母 牛后，输精器可用 75%酒精棉球由前向后擦拭消毒，待干燥后。再用生理盐水棉球擦拭后，可再用于另 一头母牛输精。 A.2.5.4 细管型冷冻精液输精器的前段接头需以高压蒸汽消毒。 接 杆部分可以 75%酒精棉球消毒， 待 干 燥
23、后，再用生理盐水棉球擦拭，每次输精，只需更换输精器接头即可。 A.2.5.5 凡是接触精液的器式如解冻小试管、颗粒及安瓿型冷冻精液输精器、贮存精液容器等均需经 彻底消毒，并再经灭菌的解冻液冲洗两次，以保持精子的适宜环境。 A.3 精液品质检查 A.3.1 精子活率评定 DB63/T 455.6 2004 2 A.3.1.1 颗粒型冷冻精液应先取 2.9%柠檬酸钠溶液 1 1.5ml， 加温 到 38 2 ， 投 入颗粒冷冻精液 一 粒，轻轻摇荡，当溶化尚余 1/2 1/3时，脱离加温使其在外界温度下溶化，用 压片法立即在 150 600 倍显策镜下检查。 A.3.1.2 检查 精子活率用显微镜
24、载物台应保持 35 38 温度。 A.3.1.3 在显微镜视野下，呈直线前进运动的精子数占全部精子数的百分率来评定精子海活率。 100% 的精子呈直线前时运动者评为 1 。 0 . 9%的精子呈直线前进运动者评为 0 . 9 ，以此类推。 A.3.2 每头份冷冻精液的直线前进运动精子数必须达到以下标准 细管型 1000万个以上 / 支 颗粒型 1200万个以上 / 粒 安瓿型 1500万个以上 / 安瓿 A.3.3 精子顶体完整率评定 采用姬姆萨染色法作显微镜观察或用干扰相差显微镜观察。每 个样品应 观 察精子总数 500个。解冻后精子顶体完整率不得低于 40%。 A.4 冷冻精子的包装、标记
25、和运输 A.4.1 冷冻精液的包装 A.4.1.1 细管型冷冻精液应封闭严密。 A.4.1.2 颗粒型冷冻精液必须以无菌容器包装。 A.4.1.3 安瓿型冷冻精液应封闭严密，耐受冷冻。 A.4.2 冷冻精液的标记 A.4.2.1 细管、安瓿的外壁和颗粒冷冻精液容器上应标记或拴系有标记牌。注明站名、公牛号、精液 制作日期、批号以及该批冷冻精液的精子活率。 A.4.2.2 不同品种公牛的冷冻精液可用不同颜色包装加以区别。 A.4.3 冷冻精液的运输 A.4.3.1 移动液氮贮存 罐时，应提握罐柄、轻拿轻放、防止冲撞。 A.4.3.2 液氮贮存罐及液氮 运输罐装车运输时，应在罐底加防震软垫。罐体应加
26、外套装入木箱，牢 固地加以拴系，防止倾倒。 A.4.3.3 运输冷冻精液应有专人押送，办理好交接手续卡片。途中应随时注意检查并及时补充冷源。 A.5 冷冻精液贮存。 A.5.1 在液氮贮存 罐内贮存的冷冻精液，必须切实地浸没于液氮中。 A.5.2 取放贮存冷冻精液的提筒，只允许上提到液氮罐的罐颈段之下，严禁提出罐外，在罐内脱离液 氮的时间不得超过 10秒。 A.5.3 在向另一液氮贮存罐内转移冷冻精液时，精液提筒不得脱离淮氮 5 秒。 A.5.4 取放冷冻精液之后，应及时盖上罐塞，以减少液氮消耗及防止异物落入罐内。 A.5.5 严防不同畜种、品种、个体公畜的冷冻精液混杂，难以辩识。 A.5.6
27、 对长期用作贮存冷冻精液的液氮罐应定期清理和洗刷。 A.6 冷冻精液的解冻 A.6.1 细管、安瓿型冷冻精液可用 38 2 温水直接浸泡解冻。 A.6.2 颗粒型冷冻精液应逐粒分别用 38 2 的 1ml 1.5ml的解冻液解冻。不 得将两粒以上的颗粒 冷 冻精液投入到一份解冻液中解冻。 A.6.3 解冻后的精液温度不得超过外界环境温度，一般应控制在 10 以下。 A.6.4 细管型冷冻精液应在 1 小时内用于输精；安瓿、颗粒型冷冻精液应在 2 小时内用于输精。 A.6.5 解冻后精液需运输时，应置于 4 5 温度下不得超过 8 小时。 DB63/T 455.6 2004 3 A.7 输精 A
28、.7.1 母牛需经发情鉴定及健康检查后才能给予输精。 A.7.2 母牛在输精前，外阴部应以清洗，以 1/3000新洁尔灭溶液或酒精棉球擦拭消毒，待干燥后，用 生理盐水棉球擦拭。 A.7.3 发情母牛每次输入一头份解冻后冷冻精液。 A.7.4 输精用精子活率应达 0.3以上，输入的直线前进运动精子数，细管型冷冻精液为 1000万 个 以 上 ； 颗粒型冷冻精液为 1200万个以上；安瓿型冷冻精液为 1500万个以上。 A.7.5 采用直肠把握输精法将精液注入到子宫颈内口或子宫体部位。 A.7.6 输精母牛须作好记录。各项记录必须按时、准确，并定期进行统计分析。 DB63/T 455.6 2004
29、 4 附 录 B （规范性附录） 牛胚胎移植技术规程 B.1 主题内容与适用范围 本规程规定了牛胚胎移植技术操作的基本原则、要求和方法； 木规程适用于牛胚胎移植技术推广应用时的规范化操作。 B.2 引用标准 GB4143 1984 牛冷冻精液 B.3 术语 B.3.1 胚胎移植 (embyotransfer) 将良种母畜配种后的早期胚胎取出， 移 植到另一头同种的生理状态相同的母畜体内， 使 之继续发 育 成一个新个体的技术。 B.3.2 供体母牛 (donor) 提供胚胎的良种母牛。 B.3.3 受体母牛 (recipient) 接受胚胎的生理状态相同的母牛。 B.3.4 超数排卵 (sup
30、erovulatlon) 母畜一般只排出一个卵子，应用激素使母畜一次排出几个甚至几十个卵子。 B.4 供体母牛及供精公牛要求 B.4.1 供体母牛：供体牛应符合本品种标准，具有较高的生产性能。供体牛年龄一般为 3 7 岁，胎次 为 9-5胎，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机能正常。产犊记录清楚，没有流产病史，产后 60天 以 上 ， 有两次正常发情记录。生殖器官正常，不得患有子宫内膜炎、卵巢囊肿和子宫过度弛缓、下垂等疾病， 长期空怀的母牛不得作供体。 2 次超数排卵反应差的母牛不再用作供体。黄体发育不良，卵巢静止的母 牛不宜用。应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。 B.4.2 供精公牛： 用
31、 于人工授精的冷冻精液一定要保证质量， 必 须符合 GB4143R的规定。 每 次授精剂 量 可以加倍。 B.5 超数排卵 B.5.1 药品：牛专用超数排卵激素 Follitrophin和氯前列烯醇 (PG)。 B.5.2 超排程序 B.5.2.1 超排前处理：牛超数排卵的处理程序一般采用连续 4 5 天、以逐渐递减的剂量每天早晚注射 FSH二次。 在 母牛发情周期的第 9 13天 ( 发情当天为第 0 天 ) 的任何一天开始第一次注射。 在 第 6 次或第 7 次注射 FSH的同时， 肌 注 PG 3 支 (0 6mg)。 以 成年奶牛采用加拿大进口促卵泡素进行超排处理为例， 将 400mg
32、促卵泡素用 20ml生理盐水稀释混匀， 在 成母牛发情后第 10天开始注射， 总 剂量为 360mg(18m1)， 具 体注射程序见表 1 。 DB63/T 455.6 2004 5 表 1 母牛超数排卵处理程序表 B.5.2.2 人工授精： 供 体牛注射 PG后， 应 密切观察发情。 供 体牛一般在注射 PG后 48小时发情 ( 范围为 2 4 -72小时 ) 。 发 情后需进行 23次人工授精。 供 体牛发情 6-10小时， 进 行第一次人工授精； 间隔 10-12小 时 后， 进行第二次人工授精。 如 实行 3 次授精， 则再间隔 10-12小时后， 进行第三次人工授精。 人 工授精 的
33、 最适时间参照表 2 。 表 2 人工授精的时间表 B.5.2.3 冲卵程序： 供 体牛超排发情后的第 7 天采用二路式冲卵管进行非手术冲卵。 首 先将供体牛在 保 定架保定，并用 2%的普鲁卡因或利多卡因在尾椎硬膜外麻醉。利多卡因剂量为： 5 10ml。用子宫颈黏 液去除器吸除黏液。 在 助手的协助下， 将带钢芯的冲卵管插入阴门， 达 到子宫颈口。 用直肠把握法将 冲 卵管插入子宫颈和子宫角。 当 冲卵管到达子宫角弯曲处时， 拔出一小部分钢芯， 将 冲卵管往前送。 当 钢 芯再次到达子宫角弯曲处时，再 拔出一小部分钢芯，将 冲卵管往前送，直 到冲卵管到达子宫角前端为 止 。 用 20ml的注
34、射器给冲卵管气囊充气约 12 18ml。拔出钢芯 ，联结三通管，进行冲卵。 检卵和胚胎标准：将冲出液体立即送人实验室检卵，检出的可用胚胎。 表 3 胚胎的分级标准表 注： 1 级、 2 级胚胎可用于鲜胚移植和冷冻保存； 3 级胚胎只能用于鲜胚移植， 不能用于冷冻保存； 4 级胚胎为不 可 用胚胎。检出的可用胚胎应尽快冷冻保存或移植。 胚胎的等级划分还应考虑到受精卵的发育程度 . 发情后第 7 8d 回收的受精卵在正常发育时应处于 致密桑椹胚至囊胚阶段 , 凡在 16 以下的受精卵及变性细胞超过 1/2 的胚胎均属等外。 B.6 胚胎的冷冻 B.6.1 冷冻前处理：胚胎检出后，经卫生处理，装管进
35、行冷冻。 发情周期 10 11 12 13 14 15 16 早晨 FSH FSH FSH FSH 8:00 9:00 3ml 2.5ml 2ml 1.5ml 人工 PG 发情 授精 3 支 晚上 FSH FSH FSH FSH 人工 人工 20:00:21:00 ml ml ml ml 授精 授精 发情时间 第一次人工授精 第二次人工授精 早晨 当天下午 第二天早晨 中午 当天晚上 第二天中午 晚上 第二天早晨 第二天晚上 1 级胚胎 胚胎形态完整 , 轮廓清晰 , 处于正常的发育阶段 , 外形匀称 , 胚胎呈球形 ; 分裂球细胞大于均匀 , 结构紧凑 , 透 明度适中 , 无附着的细胞和液
36、泡 , 没有或只有少量游离细胞。 2 级胚胎 轮廓清晰 , 色调和细胞密度良好 , 可见到一些附着的细胞和液泡 , 变性细胞约占 10% 30%,发育稍迟缓，有 少量游离细胞，（ 少于 20%）， 细胞团完整，胚胎仍呈球形，细胞之间结合紧密。 3 级胚胎 轮廓不清晰 , 色调发暗 , 结构较松散 , 发育迟缓 1 2 天 ，卵裂 球 大 小 不 均 匀 ，透明 度 变 化 明 显（太 暗 或 太 明 ） ， 胚胎游离细胞较多，（ 大于 20%，小于 50%）， 变性细胞达 30% 50%,细胞联结不够紧密，但胚胎仍呈球形，有明显的细 胞团结构。 4 级胚胎 发育迟缓（ 2 天以上）； 细胞团破
37、碎，细胞死亡退化。 DB63/T 455.6 2004 6 B.6.1.1 乙醇为冷冻保护液的胚胎装 管方法：吸 人约 3cm保存液、 0.5cm气泡、 0.5cm冷冻液、 0.5cm 气泡、适量冷冻液及一枚胚胎、 0.5cm气泡、 0.5cm冷冻液、 0.5cm气泡，适量保存液。即五段液体、四 个气泡，边上两段液体为保存液，中间三段为冷冻液。 B.6.1.2 甘油为冷冻保护液的胚胎装 管方法：用 0.25ml的专用细管，吸人约 4cm长的保存液、 0.5cm 长的气泡、适量保存液及胚胎、 0.5cm气泡、 4cm保存液，装管后为三段液体夹二段气泡，中间一段液 体存放胚胎。 B.6.1.3 冷
38、冻细管的标记： 在胚胎细管上， 应标记生产单位、 品种、 公母牛号、 胚胎编号、 冷冻方法 、 胚胎发育期与级别、胚胎数量和生产日期。一般制作一个标签，贴在细管封口塞上。 B.6.2 胚胎冷冻：将冷冻仪的冷冻室预冷至植冰温度 ( 甘油冷冻液为 -65 ，乙二醇冷冻液为 -55 ) ， 将装有胚胎的细管放人冷冻室，平衡 5 10分钟，植冰，再平衡 5 10分钟，然后以 0.3 分钟的降温 速率降温至 -35 或 32 ，平衡 10分钟后，将细管投入液氮保存。 B.7 受体牛的选择标准 受体牛应有正常的两个以上发情周期；无繁殖机能疾病，无传染病 ( 特别是布氏杆菌病 ) ；身体健 康， 膘情在七成
39、以上 ( 如按进级膘情分级， 应以 3 4 级为宜 ) ； 牛龄为 3 6 岁； 经产牛分娩在六十天 以 上；产犊性能和泌乳性能良好；人工授精两次或胚胎移植两次不孕者不使用；无流产史；上胎无难产、 助产情况；性情温顺者；子宫弹性厚薄正常者；黄体达到 A、 B 级者；青年牛达到 16 月龄以上，体重 达到成年母牛体重的 75%。 B.8 移植前处理 B.8.1 受体牛的饲养管理 受体牛在移植前 45 天开始补饲，保 持日增重 0.30 0.40kg日。在 移植前 6 8 周注射 VA、 B、 D、 E 针剂，补充微量元素，如硒、锌等。 受体牛单独组群饲养，保持环境相对稳定，避免应激反应。 B.8
40、.2 牛胚胎移檀的适宜季节 放牧型牛移植季节应选在 8 11 月，舍饲牛应避开最冷最热的季节，其它季节也可进行移植。 B.8.3 受体牛的发情鉴定 应对受体牛跟群观察，以受体牛稳定站立接受其它牛爬跨为发情标准。并准确记录开始站立接受 爬跨的时间 ( 以小时为单位记录 ) 。 B.8.4 受体牛的同期发情技术 同期化处理之前对受体牛进行直肠检查， 检 查卵巢是否处于活动状态。 处 于活动状态的牛方可进 行 同期化发情处理。 药品：氯前列烯醇 ( P G) ： 0.2m g 2m l 支。 剂量：经产牛 0.4m g 次，育成牛 0.3m g 次。 方法：二次注射法，肌注。 第一次注射：在任意一天
41、。 第二次注射：在 第一次注射后 11 天。第 二次注射后 24 96 小时观察发情。受 体牛发情之日计为 0 天， 6-8 天内进行胚胎移植。 B.9 胚胎解冻和移植 B.9.1 受体牛移植操作步骤 B.9.1.1 三步平衡法冻胚的解冻 DB63/T 455.6 2004 7 B.9.1.2 解冻液的配备： 将 10%、 6%和 3%甘油的 PBS ( 培养液 ) 保存液， 用 0 22 pan滤器灭菌， 分装 在 小培养皿内， 第 1 杯为含 10%甘油的 PBS保存液， 第 2 杯为含 6%甘油的 PBS保存液， 第 3 杯为含 3%甘油的 PBS 保存液，第 4 杯为不含甘油的 PBS
42、保存液。 B.9.1.3 胚胎的解冻：胚胎从液氮中取出在 3s内投入 35 水浴浸 10s。 B.9.1.4 三步脱甘油： 用 70%酒精棉球消毒解冻后塑料吸管和剪刀刀刃， 剪 去棉塞端， 与 带有空气的 l m l 注射器连接上。 再 剪去吸管的另一端， 在 室温下将胚胎推人 10%甘油和 0.3mol L 蔗糖 PBS保存液中， 放 置 5min，以后陆续移人 6%和 3%甘油蔗糖的 PBS保存液中，各放置 5min，最后移至不含甘油的 PBS保存液 中镜检待用。 B.9.2 一步吸管法解冻 B.9.2.1 解冻方法：从液氮中取出装有胚胎的塑料吸管，投人 37 38 温水中，水浴 10s。
43、 B.9.2.2 脱甘油：手提塑料吸管、棉塞向下甩 2 3 次，将气泡甩向棉塞端，使蔗糖液和保存 液混合。 或者用手指轻弹气泡，使两种液体混合，将棉塞向下直立 10min。 B.9.2.3 观察胚胎：用特制塑料吸管观察镜或显微镜的目镜，通过塑料管壁从上到下转动观察胚胎的 形态和位置，确定后用 70%酒精棉球消毒并切除吸管上层 1cm，切口要平整，可直接用于移植。 B.10 胚胎的鉴定 B.10.1 在 100 200倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、 色 调、 分裂球的大小、 均 匀度、 细胞的 密 度、与透明带的间隙以及变性情况等。 B.10.2 凡卵子的卵黄未形成分裂球及细胞团的，均列为
44、未受精卵。 B.10.3 胚胎的发育阶段：通常受精后 6 8d非手术回收的正常受精卵发育情况如下。 B.10.3.1桑椹胚：发情后第 5 6d回收的卵，只能观察到球状的细胞团，分不清分裂球，占据透明带 内腔的大部分。 B.10.3.2致密桑椹胚：发情后第 6 7d回收的卵，细胞团变小，占透明带内腔 60% 70%。 B.10.3.3早期囊胚： 发 情后 7 8d回收的卵， 细 胞的一部分出现发亮的胚泡腔。 细 胞团占透明带内腔 7 0% 80%，难以分清内细胞团和滋养层。 B.10.3.4囊胚：发情后第 7 8d回收，内细胞团和滋养 1 层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满透明带 内腔。 B.10
45、.3.5扩大囊胚：发情后第 8 9d回收，胚泡腔明显扩大，体积增大到原来的 1 2 1 5 倍，与透 明带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的 1 3 。 B.10.3.6孵育胚： 一 般在发情后 9 11d回收的受精卵， 由 于胚泡腔继续扩张， 致使透明带破裂， 卵 细 胞脱出。 B.10.3.7凡在发情后 6 8d回收的 16细胞以下的受精卵均应列为非正常发育卵，不能用于移植。 B.11 移植 B.11.1 移植受体牛检查 要求受体牛发情时直肠检查的卵泡直径在 10 20mm左右，发情后 36h出现排 卵。移植前直检黄体，其直径在 11 15mm以上，黄体的手感性好，质地软而充实。 B
46、.11.2 受体牛的准备 将受体牛保定，清除粪便，肌注 2%静松灵 lml或用 2%的普鲁卡因 3ml在 1 2 尾 椎间硬膜外麻醉。清洗外阴，用高锰酸钾水冲洗消毒，用灭菌纸擦干，最后经酒精棉球消毒。 B.11.3 器械准备 仿西德式金属移植器， 先 将移植枪、 枪 头及金属保护外套分别用纸包扎好， 高 压 消 毒。塑料卡苏式移植枪需经气体灭菌。移植时先用 70%酒精棉球消毒装有胚胎的塑料吸管，然后剪掉封 口一端，装入移植枪内，套上保护外套。 B.11.4 移植前胚胎装管 胚胎移植时可用 0.25ml吸管分三段吸人 PBS保存液，中间由两个气泡隔开， 中段含有胚胎。 也 可用小汽泡分成多段装管
47、， 胚胎在中段。 一 步吸管法解冻脱甘油后， 用酒精棉球多 次 消毒吸管，、 剪去封口即可用于移植。 DB63/T 455.6 2004 8 B.11.5 移植 术者用左手扒开外阴， 右 手持移植器插入阴道， 然 后左手伸进直肠， 移 植器到达子宫 颈 口时， 右 手用力将移植枪捅破外套填片， 插 入子宫颈。 左 手在直肠内诱导使枪头轻轻稳妥地插人黄体 侧 子宫角至大弯处，持移植器的右手推出胚胎，缓慢旋转地抽出移植器。 受体牛在发情后 6 8 天之间均可进行移植 ( 发情之时定为 0 小时 ) ， 移 植前对受体牛进行直肠触摸 ， 检查黄体是否合格。合格者用于移植。受体牛实行 1 2 尾椎间硬
48、膜外麻醉，擦拭外阴部。 对照供体牛采胚记录表和合格受体的发情记录，合理地搭配受体和胚胎。 解冻胚胎：冷冻胚胎细管 空气浴 (20 )10秒 32 35 水浴 10秒 无菌棉擦干细管 拧下细 管塞。 用乙二醇做冷冻保护液的胚胎可直接将细管装入移植枪立即移植，应在 5 分钟内移植给受体牛。 用甘油做冷冻保护液的胚胎先用三步法脱除甘油 ( 脱甘油方法：首 先将胚胎推人 10%甘油冷冻液中 ， 逐步移人 6 6%、 3 3%和不含甘油的溶液中。 ) 再将胚胎用保存液洗 涤 5 次，按 “ 三、胚胎的冷冻 ” 中的方法重新装入细管， 装 移植枪进行移植， 把装有细管的移植枪套上硬外套， 用 塑料环卡紧，
49、 再套 上 软外套，将胚胎移植到受体有黄体一侧子宫角的上 1 3 1 2 处。 做好受体移植记录。 B.12 妊娠诊断 B.12.1 直肠检查法 通常在移植后三个月开始检查。 妊娠 90天时， 子宫继续增大， 落 人腹腔， 可感觉到胎儿的浮动， 孕 角出现孕脉，子宫壁可触到子叶。 B.12.2 超声波诊断（ B 超） 对妊娠 25天以上的受体牛可用 B 超检查。利用控头通过直肠轻轻地在子宫角滑地动，在荧光屏上便 可观察到周围黑色中间有一个长 12cm灰白色图象，即是胎儿，胎儿 60日龄时为 6 7cm长， 90日龄时为 14 17cm长。 使用 B 超探头检查时要特别注意，防止动作过重、检查过度，以免引起流产。 B.13 妊娠受体牛的饲养管理 在移植后 70 90天， 对 受体牛进行妊娠检查， 对已妊娠的受体要加强饲养管理， 避 免应激反应。 妊 娠受体在产前 3 个月要补充足量的维生素、微量元素，适 当限制能最摄入， 既要保证胎儿的 正常发育， 又要避免难产。 三种不同甘油浓度的配制表 组成成分 1M 蔗糖液 10%甘油冷冻液 保存液 66%甘油液 0.5ml 1.0ml 0ml 33%甘油液 0.5ml 0.5ml 0.5ml 不含甘油液 0.5ml 0m
