1、 ICS 65.020.30 B 43 备案号：60856-2018 DB63 青 海 省 地 方 标 准 DB 63/T 16922018 八眉猪细管冻精生产技术规程 2018 - 09 - 25发布 2018 - 12 - 01实施 青海省质量技术监督局 发 布 DB 63/T 16922018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由青海省农牧厅提出并归口。 本标准起草单位：青海省家畜改良中心。 本标准主要起草人：马元梅、张楠、冯宇诚、张晋青、常永梅、赵春川、王芳、郭占泽、赵青山、 许发芳、莫常山、王朝风、何得仓、李景、刘于刚。 DB 63/T 1692
2、2018 1 八眉猪细管冻精生产技术规程 1 范围 本规程规定了种公猪的选择和调教、采精前准备、采精、精液处理、精液冷冻、细管冻精解冻和镜 检、包装、标记和贮存、细管冻精质量评价等内容。 本规程适用于八眉猪细管冻精的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4143 牛冷冻精液 GB/T 5458 液氮生物容器 NY/T 2823 八眉猪 3 种公猪的选择和调教 3.1 种公猪的选择 种公猪应符合NY/T 2823要求，三代系谱清楚。 3.2
3、种公猪的饲养管理 种公猪单圈饲养。定时定量饲喂，以精料为主，满足其营养需要，消化能需要量为28.45 MJ，体重 90 kg以下的公猪粗蛋白需要量为14%，90 kg以上为12%，每千克饲料含维生素A 3531 IU，维生素E 11 IU。 供给充足清洁饮水。经常刷拭猪体，保持清洁。每天适度运动1 h2 h。 3.3 种公猪的调教 选择发情旺盛的母猪并固定，引诱公猪爬跨，待其爬上母猪后，将公猪阴茎导入空拳内进行采精， 反复训练2 次3 次。 4 采精前准备 4.1 器械 4.1.1 仪器设备 37 恒温箱、17 车载恒温箱、水浴锅、移液枪、密度仪、显微镜、离心机、冰箱、低温柜、细 管封装一体机
4、、程控冷冻仪、液氮生物容器、干燥箱。 4.1.2 器具 DB 63/T 16922018 2 保温集精杯、过滤膜、比色皿、锥形瓶、载玻片、盖玻片、离心管、烧杯、量筒、0.25 ml细管、 提筒、试管、细管剪。 4.2 器械的清洗 4.2.1 仪器设备的清洗和消毒 各仪器设备应定期用紫外灯照射消毒。使用结束后，应用洁净、柔软的布将残留的精液、水、污物 擦拭干净。 4.2.2 器具的清洗和消毒 各器具使用后浸泡在自来水中。洗涤时，先在加有洗涤剂的温热水中刷拭，然后用清水反复冲洗干 净，最后用蒸馏水冲洗。载玻片和盖玻片洗净后用柔软的布擦干备用，其他玻璃器皿将水晾干后放入干 燥箱，加热至160 恒温6
5、0 min，自然冷却后待用。0.25 ml细管应置于紫外灯下消毒，其他非玻璃材 质的器具洗净后自然晾干，用75 %酒精棉球擦拭消毒。 4.3 采精场所的卫生和消毒 采精场所保持安静，地面保持清洁卫生，采精前应喷洒0.1 %高锰酸钾进行消毒。 4.4 稀释液配制 4.4.1 常温保存稀释液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，分别称取葡萄糖37 g、乙二胺四乙酸1.25 g、二水柠檬酸钠0.6 g、 碳酸氢钠1.25 g、氯化钾0.075 g，溶解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤 液煮沸15 min，待温度降至常温，称取青霉素钠0.6 g、硫酸链霉素1 g加入滤液中并混
6、匀。 4.4.2 冷冻基础液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，分别称取葡萄糖11 g、柠檬酸14.8 g、三羟甲基氨基甲烷24.2 g， 溶解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤液煮沸15 min，待温度降至常温，称 取青霉素钠0.6 g、硫酸链霉素1 g加入滤液中并混匀。 4.4.3 冷冻稀释液I液配制 向锥形瓶中加入800 ml冷冻基础液、200 ml新鲜卵黄，搅拌均匀，置于17 备用。 4.4.4 冷冻稀释液II液配制 向锥形瓶中加入940 ml冷冻稀释液I液、60 ml甘油，搅拌均匀，置于5 备用。 4.4.5 解冻液配制 向锥形瓶中加入1000 ml双蒸水，
7、分别称取葡萄糖50 g、二水柠檬酸钠3 g、乙二胺四乙酸1 g，溶 解于双蒸水中，搅拌均匀，用定性滤纸过滤至另一锥形瓶中，滤液煮沸15 min，待温度降至常温。 5 采精 5.1 台猪和种公猪的准备 DB 63/T 16922018 3 选择健壮、大小适中、性情温顺的母猪做台猪。采精前用清水冲洗台猪的外阴、臀部和公猪阴茎、 包皮及其周围腹壁，然后用0.01 %高锰酸钾溶液对公猪被清洗过的部位消毒，再用温水冲洗干净。 5.2 采精频率 后备种公猪每周采精一次，成年种公猪每周可采精两次。 5.3 采精方法 从37 恒温箱中取出保温集精杯，杯口覆盖过滤膜。采精员戴乳胶手套，蹲在台猪的一侧，诱导 公猪
8、爬跨台猪，按摩公猪睾丸，待公猪阴茎伸出后导入空拳内并握紧，当阴茎充分勃起后顺势向前牵拉， 手指有弹性并具有节奏的松握，引起公猪射精。另一手持保温集精杯采集中段精液，弃去前、后段精液。 取下过滤膜，盖保温盖。 6 精液处理 6.1 准备 凡接触精液的器皿均放在37 恒温箱内，装有常温保存稀释液的锥形瓶置于37 水浴锅待常温保 存稀释液温度升至37 。 6.2 原精质量要求 6.2.1 原精外观要求 精液为乳白色，无皮毛等异物，略带腥味。 6.2.2 体积 将精液倒入量杯内直读精液体积。精液体积100 ml。 6.2.3 密度测定 用移液枪吸取3960 l生理盐水于比色皿中，再吸取40 l精液，同
9、生理盐水混合均匀，用密度测 定仪测定精子密度。每毫升精液精子密度1 10 8 个。 6.2.4 精子活力和畸形率 取一小滴精液于载玻片，加盖盖玻片在带有38 恒温装置的显微镜下检查精子活力和畸形率。精 子活力60%，精子畸形率15%。 6.3 精液常温稀释 用37 常温保存稀释液按11的比例等温稀释精液，将混合液放入17 恒温箱待其温度降至17 ，并于72 h内完成冻精。 6.4 精液离心和上清液体积测定 将常温稀释后的混合液倒入50 ml离心管中，在17 、重力800 g的条件下离心12 min，吸取上清 液于量筒，直读体积。 6.5 冷冻稀释液添加量计算 DB 63/T 16922018
10、4 6.5.1 最终精子总数计算 离心后精子总数按式（1）计算： 1 vn .(1) 式中： n最终精子总数，单位为个； 每毫升精液精子密度，单位为个； v1精液体积，单位为毫升（ml）。 6.5.2 精子体积计算 离心后沉淀精子体积按式（2）计算： 21 vvv .(2) 式中： v精子体积，单位为毫升（ml）； v1精液体积，单位为毫升（ml）； v2上清液体积，单位为毫升（ml）。 6.5.3 最终精液总量计算 保证最终每毫升精液中精子密度310 8 个，最终稀释后精液总量按式（3）计算： 3 ns .(3) 式中： s最终精液总量，单位为毫升（ml）； n最终精子总数，单位为个。 6.
11、5.4 冷冻稀释液添加量计算 冷冻稀释液I液和II液添加量按式（4）计算： 2 21 vs aa .(4) 式中： a1冷冻稀释液I液添加量，单位为毫升（ml）； a2冷冻稀释液II液添加量，单位为毫升（ml）； s最终精液总量，单位为毫升（ml）； v精子体积，单位为毫升（ml）。 6.5.5 精液低温稀释 用17 的冷冻稀释液I液等温稀释6.3中温度降至17 的混合液；将装有稀释后精液的锥形瓶置于 装有17 水的烧杯中，放入5 冰箱平衡2 h。用5 的冷冻稀释液II液等温稀释,经平衡、温度降至5 的精液。冷冻稀释液I液和II液添加量按照6.5.4计算。 7 精液冷冻 DB 63/T 169
12、22018 5 7.1 细管封装 7.1.1 细管要求 细管为无毒、耐低温的专用塑料管，0.25 ml剂型，保证清洁、无菌。 7.1.2 封装 在4 低温柜中采用细管封装一体机通过计算机程序控制，进行灌装、封口、打印标识。 7.1.3 细管标识 细管标识清晰，信息齐全，包括冻精产地、品种、冻精生产日期、猪号。 7.2 上架 封装后的细管整齐的码放在专用细管架上。 7.3 冷冻 采用程控冷冻仪冷冻，按照预先设定的最佳冷冻曲线自动完成冷冻。最佳冷冻曲线降温速率为：4 1 （降温速率2 / min），共1 min 30 s；1 -25 （降温速率30 /min），共2 min 24 s； -25 -
13、140 （降温速率30 / min），共6 min 12 s；-140 保持30 s。 7.4 细管冻精收集 冷冻完成后，按猪号取出细管冻精投入盛满液氮的提筒中，细管的超声波封口端在上，棉塞端在下， 并迅速浸入液氮中。 8 细管冻精解冻和镜检 8.1 细管冻精解冻 预先将水浴锅温度调至38 ，将解冻液加入试管，并浸泡在38 水浴锅中预热。用长柄镊子取一 支细管冻精迅速浸入38 水浴锅中晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细管剪 剪去超声波封口端，用推针将精液注入预先升温至38 的试管中，用38 解冻液按精液与解冻液1：3 的比例进行稀释。 8.2 活力检测 方法见本标准的6.2
14、.4。活力30%的细管冻精作为初检合格品妥善贮存。 9 包装、标记和贮存 9.1 包装 用无菌纱布袋包装，包装应在-140 以下环境中进行。 9.2 标记 包装袋外应进行明显标记。注明公猪号、生产日期、数量、精子活力。 DB 63/T 16922018 6 9.3 贮存 用液氮生物容器贮存细管冻精，液氮生物容器符合GB/T 5458要求。设专人保管，每周定时加一次 液氮，液氮应浸没冻精。应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器外壳结白霜，立即将细管冻精转 移到其他液氮生物容器内保存。取放细管冻精时，提筒在容器颈下，冻精离开液氮的时间不得超过5 s。 取放之后，及时盖好容器塞。 10 细管冻精质量评价 10.1 细管冻精质量检验规则和方法 每季度每头公猪细管冻精型式检验不少于一次，检验方法按照GB 4143进行。出站时应检验细管冻 精外观和精液品质，检验合格方可交付使用。 10.2 细管冻精型式检验质量评价 10.2.1 细管外观 细管无裂痕、两端封口严实。 10.2.2 剂量 精液剂量0.18 ml。 10.2.3 精子活力 精子活力30%。 10.2.4 精子畸形率 精子畸形率18%。 10.2.5 精子密度 每毫升精液精子密度310 8 个。 10.2.6 细菌数 精液中细菌数800个。 _
