1、 ICS 65.020.30 B 43 备案号：48512-2016 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 14352015 藏獒细管冷冻精液生产技术规程 2015 - 12 - 21 发布 2016 - 03 - 20 实施 青海省质量技术监督局 发布 DB63/T 14352015 I 前 言 本规程依照GB/T 1.1-2009编写。 本规程由青海省农牧厅归口。 本规程由青海省家畜改良中心起草。 本规程主要起草人：胡宁玺、薛晓蓉、张晋青、杨桂梅、马元梅、常永梅、赵静、刘宁、逯玉、袁 海洲、白坤云、潘顺利、赵莉渲、郭靓、周倩、郭万春、郭占泽。 DB63/T 14352015 1 藏獒细
2、管冷冻精液生产技术规程 1 范围 本规程规定了藏獒细管冷冻精液生产的基本要求、稀释液配制、采精、精液处理、细管标识、精液 冷冻、冻精包装、标记和贮存等。 本规程适用于藏獒细管冷冻精液的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 5458 液氮生物容器 NY 1870 藏獒 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 种公獒 经国家畜牧行业组织评定，符合NY 1870的B级以上公獒。 3.2 采精 用人工模拟的方法获得公獒精液。 3
3、.3 采精量 公獒射精时第二段的精液量。 3.4 精子密度 每单位体积精液中的精子数目。单位为亿每毫升。 3.5 细管冷冻精液 DB63/T 14352015 2 在细管内注入精液经液氮冷冻所形成的产品。简称“细管精液”或“冻精”。 4 准备 4.1 冻精制作室的要求 室内清洁卫生，做到无菌操作。 4.2 仪器设备 用于藏獒细管冷冻精液生产的仪器设备见表1。 表1 仪器设备 序号 设备名称 参数 1 精液细管喷码机 2 细管封装机 5 250 支0.25 毫升 3 精液密度仪 0.21 毫升0.23 毫升 4 精液程控冷冻仪 45 -140 5 相差显微镜 100 倍400 倍 6 电子天平
4、0.0 001 克 4.3 器械清洗和消毒 4.3.1 玻璃器皿 首次使用的玻璃器皿用自来水冲洗后放入5%稀盐酸中浸泡12小时,取出后立即用自来水冲洗，再用 手工或超声波清洗器在加有洗涤剂的温热水中进行刷拭，然后用自来水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗， 直至器皿光亮、无水滴附着。将洗净的玻璃器皿放置于电热干燥箱内，加热至160 后再恒温60分钟， 自然冷却后使用。使用过的玻璃器皿用自来水冲洗，遇有污物或油垢不易清洗的器皿，放入重铬酸钾洗 液中浸泡数小时，取出后立即用自来水冲洗，后续步骤同上。 4.3.2 纱布 纱布清洗干净紫外线消毒 30 分钟后待用。 4.3.3 其它器具 金属镊子、止血钳、药匙
5、、胶塞和吸管胶头等用75%酒精棉球擦拭消毒，待酒精挥发尽后方能使用。 细管、冷冻架使用前用紫外线消毒30分钟。 4.4 稀释液的配制 稀释液的配制按照附录A进行。 5 采精 5.1 种公獒的选用条件 DB63/T 14352015 3 种公獒必须健康，无遗传疾病，无农业部规定的动物疫病。 5.2 采精年龄 18月龄以上。 5.3 采精频率 成年种公獒在繁殖季节每周可采精2天。每天采精1次。 5.4 采精 采集藏獒第二部分乳白色精液。藏獒的采精可参照附录B进行。 6 精液的处理 6.1 精液处理准备 凡接触精液的器皿均应放置于34 恒温箱中，稀释液置于34 恒温水浴箱中备用。对盛装稀释精 液的稀
6、释瓶做明显标记。 6.2 精液要求 所采集的藏獒精液质量指标应符合表2的要求，有一项不符合的精液不得用于生产冻精。 表2 精液质量指标 序号 项目 质量指标 试验方法 1 外观 为乳白色或微黄，略有腥味。 自然光下目测。 2 精子活力（%） 65 取精液或稀释精液5微升10微 升于载玻片上，加盖盖玻片后在38 恒温装置的400倍显微镜山评定活 力。 3 精子密度（亿/毫升） 6 用精液密度仪测定。 6.3 精液稀释与平衡 6.3.1 精液稀释量确定和活力评定 根据鲜精液的密度、活力、采精量等确定应加入的稀释液量，确保每剂冻精所含直线前进运动精子 数的要求。精液稀释后和平衡后应评定活力。 6.3
7、.2 稀释方法与平衡 按附录A配制第液及第液。用34 的第液缓慢地加入精液中，摇匀，所加第液的量为所加 稀释液总量与精液量总和的一半减去精液量，用烧杯盛适 量的34 水，把稀释管置于4 5 低温 柜内降温，与此同时把第液也放入。稀释后的精液，采用逐渐降温法。在1小时 1.5 小时内，使稀 释精液的温度降到4 5 ，然后再在同温的恒温容器内平衡1小时 2小时。冷冻前半小时加入第 DB63/T 14352015 4 液，所加第液的量为所加稀释液总量减去所加第液的量。加入第液后平衡半小时，然后在低温 柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻。 6.4 冻精制作 6.4.1 细管的封装与冷冻 6.4
8、.1.1 细管要求 细管为无毒、耐低温的专用塑料管。保证清洁、无菌。 6.4.1.2 封装 在低温柜中进行分装。采用自动灌封机通过计算机程序控制设备的运转，使之自动、准确地把精液 灌装到细管中，封口、打印标识。 6.4.1.3 细管标识 细管冻精应在管壁上印制以下内容并且印制标识清楚： a) 生产站名； b) 藏獒品种及等级； c) 冻精生产日期； d) 藏獒号。 细管冻精标识按照附录 C 进行。 6.4.2 细管精液的冷冻 采用程控冷冻仪冷冻。依据使用者设定好的最佳冷冻曲线由电子计算机控制冷冻仪完成冷冻。推荐 最佳冷冻曲线降温速率为： 4 -10 ， 降温速率3 /min ； -10 -10
9、0 ， 降温速率40 /min； -100 -140 ，降温速率20 /min。 6.4.3 冻精收集 每冻完一批（只）精液，应立即放入液氮中浸泡，然后计数，取样检查和包装。 7 包装、标记和贮存 7.1 包装 用无菌纱布袋包装。 7.2 标记 包装袋外面，均应有明显的标记。注明藏獒号、生产日期或批号、数量、精子活力。 7.3 贮存 用液氮生物容器贮存藏獒冻精，液氮生物容器应符合GB/T 5458 要求。容器内液氮必须浸没冻精。 盛装细管冻精的容器外面，均应有明显的标记。注明生产单位、藏獒号、精液制冻日期以及该批冻精的 精子活力和份数。应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器异常，立即将冻精转
10、移到其他完好的容 DB63/T 14352015 5 器内。取放冻精时，提筒只许提到容器的颈下，严禁提到外边，停留时间不得超过10秒。如向另一容器 转移冻精时，盛冻精的提筒离开液氮面的时间不得超过5秒。取放冻精之后，应及时盖好容器塞。 DB63/T 14352015 6 A A 附 录 A （规范性附录） 稀释液的配制 A.1 化学试剂要求 所有化学试剂为二级品以上的化学试剂；卵黄来源于非疫区无疫病鸡场的新鲜鸡蛋；稀释液溶剂应 用新鲜的双重蒸馏水。 A.2 器具要求 所用器具保证清洁、无菌。 A.3 稀释液配方 双蒸馏水100毫升，三羟甲基氨基甲烷3.025克，果糖 1.275克，柠檬酸三钠1
11、.7克，甘油6毫升，卵 黄20%。 A.4 稀释液的配制方法 分为基础液、第液、第液的配制： a) 基础液的配制：先准确称取柠檬酸三钠 1.7 克，果糖 1.275 克 ，三羟甲基氨基甲烷 3.025 克， 放入容器为 100 毫升的量筒内，加蒸馏水 50 毫升左右，用消毒过的玻璃棒搅拌，待溶解后再 加蒸馏水定容至 100 毫升，混匀后用滤纸过滤于三角烧杯中，扎好瓶口，置水浴锅中隔水煮沸 消毒 30 分钟。 b) 第液的配制：取冷却后（室温）基础液 80 毫升于三角烧瓶中，加入卵黄 20 毫升，用磁力 搅拌器充分搅拌均匀。 c) 第液的配制：取第液 47 毫升，加入隔水煮沸消毒好的甘油 3 毫
12、升充分搅拌均匀。 注1： 以上各液每 100 毫升加青、链霉素各（510）万单位。 注2： 稀释液要现配现用。 DB63/T 14352015 7 B B 附 录 B （资料性附录） 藏獒的采精 B.1 场地的准备 采精场所应保持安静，地面平整，清洁卫生，采精前做彻底消毒。 B.2 台犬选择 选择发情好的健康母犬作台犬。采精前台犬的后躯、尾根部、外阴部、肛门部位，都应彻底洗涤清 洁，再用消毒过的干抹布擦干。 B.3 公獒的调教 从15月龄开始调教。选择发情旺盛、性情温驯、与公獒体格相适应的发情母獒作为台犬。待公獒爬 上台犬后，操作人员按摩其睾丸及阴茎，使阴茎勃起，这样经数次调教即能适应人工采精
13、操作。待种公 獒习惯于人工采精，并建立了条件反射后，不再以母獒作台獒，可直接进行采精。 B.4 采精操作 采精时，给公獒佩戴好嘴笼，公獒站在平坦的地面上，由饲养员或熟人抓住项圈保定。采精员先用 干净的毛巾将公獒包皮周围擦干净，用温生理盐水清洗公獒的阴茎部，并用热毛巾擦干。操作时戴上乳 胶手套，右手轻缓地抓住公獒阴茎，左手拿住集精杯调整以合适的姿势准备收集精液。用右手拇指和食 指握住阴茎，将包皮稍用力上推，露出阴茎龟头，反复几次，待龟头球稍有硬度，即将龟头球握在手掌 内并给予适当有节奏的压力，此时公獒的阴茎会充分勃起，大约经20秒即发生射精，待其射出透明的第 一部分水样液体后， 左手迅速将集精杯
14、接在阴茎下部， 右手继续按摩， 待乳白色的第二部分精液射出后， 移走集精杯，用吸管将精液移入有刻度的集精管内，进行鲜精常规检查。 DB63/T 14352015 8 C C 附 录 C （规范性附录） 细管的标识 C.1 细管冷冻精液标识由四部分组成 生产单位、藏獒品种及等级、冻精制作日期、獒号。 第一部分生产单位代号以该单位所在省汉语拼音的第一、第二、第三个字的大写字母表示；第二部 分藏獒品种及等级代号以英文Tibetan Mastiff 的首字母表示；特A级代号“TA” ；A级代号“A”；B 级代号“B”；第三部分冻精制作日期按年月日次序排列，年月日各占二位数，月、日不够二位的，月、 日前分别加“0”补充为二位数。第四部分獒号以该单位所在省代号（按国家统一规定的省、区、自治 区代号）及獒出生日期表示。 C.2 四部分的排列顺序 第一部分 第二部分 第三部分 第四部分 生产单位代号 品种及等级代号 冻精制作日期代号 獒代号 细管标记示例： QHS TM TA 140215 631100208 注： QHS为青海省家畜改良中心代号，TM TA为藏獒特A级代号， 140215为201 4年2月15日冻精生产日期代号， 631100208为该藏獒2010年2月8日出生。 _
