1、ICS 65.020.20 B 21 备案号：49250-2016 DB63 青 海 省 地 方 标 准 DB63/T 14782016 青海扁茎早熟禾 SSR分子标记鉴定技术规程 2016 - 03 - 21发布 2016 - 05 - 01实施 青海省质量技术监督局 发 布 DB63/T 14782016 I 前 言 本规程按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本规程由中国科学院西北高原生物研究所提出并归口。 本规程负责起草单位：中国科学院西北高原生物研究所 本规程主要起草人：窦全文、赵闫闫、王海庆、汪新川、喻凤、李媛、刘瑞娟、陈志国、刘德梅。 DB63/T 14782016 1
2、 青海扁茎早熟禾SSR分子标记鉴定技术规程 1 范围 本规程规定了青海扁茎早熟禾品种真实性和纯度SSR分子标记鉴定的设备、试剂配制、操作程序、 SSR引物以及判定原则等技术内容。 本规程适用于种子管理部门、农业科研、教学、生产、推广等单位对多年生牧草品种青海扁茎早熟 禾真实性及纯度的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 SSR：简单重复序列 DNA：脱氧核糖
3、核酸 dNTPs：四种脱氧核糖核苷酸 PCR：聚合酶链式反应 4 仪器、设备与试剂 仪器、设备与试剂见附录A。 5 试剂配制 5.1 DNA提取试剂 5.1.1 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液 称取EDTA-Na22H2O 9.306 g，加去离子水35 mL，剧烈搅拌，用NaOH颗粒0.80 g1.11 g调pH至8.0， 定容至50 mL，终浓度为0.5 mol/L。 5.1.2 三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris- HCl）溶液 称取Tris 6.060 g，加超纯水40 mL溶解，滴加浓HCl 1.8mL2.2 mL调pH至8.0，定容至50 ml，终 浓度为0.5 mol/L。 5.
4、1.3 DNA提取液 DB63/T 14782016 2 称取十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）8.0 g，氯化钠32.7 g，Tris- HCl盐酸溶液（0.5 mol/L）10 mL， EDTA溶液（0.5 mol/L）4 mL，混合，再用去离子水定容至400 mL。 5.1.4 三氯甲烷和异戊醇混合液（24：1） 量取三氯甲烷240 mL和异戊醇10 mL，混匀,此溶液配制在通风橱进行。 5.1.5 70%乙醇 5.1.6 10倍DNA溶解液 Tris- HC溶液（0.5 mol/L）10 mL，EDTA溶液（0.5 mol/L）2 mL，先加入到50 mL去离子水中，溶 解混合均匀，再定
5、容至100 mL，高温高压灭菌（121，15分钟），室温保存。 5.1.7 1倍DNA溶解液 取10倍DNA溶解液10 mL，加入90 mL去离子水，混匀。 5.2 PCR扩增试剂 5.2.1 dNTPs混合溶液 取浓度为100 mmol/ L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 储存液各25 L混合，加入去离子水900 L， 配成终浓度为2.5 mmol/ L 工作液。-20 条件下保存。 5.2.2 引物稀释 用去离子水配制引物浓度为100 M 的储存液，取10 L储存液加人 90L 去离子水配成10 M工作 液。 5.3 聚丙烯酰胺凝胶试剂 5.3.1 5倍电泳缓冲液 分别称取T
6、ris 54.0 g，硼酸27.5 g，放于1000 mL烧杯中，加入蒸馏水800 mL，充分搅拌溶解，再 加入EDTA溶液（0.5 mol/L）20 mL，混匀，定容至 1 000mL。 5.3.2 30%丙烯酰胺 分别称取丙烯酰胺29.0 g和甲叉双丙烯酰胺1.0 g，并放于100 mL 烧杯中，加入蒸馏水80 mL，充 分搅拌，定容至100 mL，用滤纸过滤，于棕色瓶中 4保存。 5.3.3 10%过硫酸铵 称取过硫酸铵0.100 g，并放于1.5 mL离心管中。 加入蒸馏水1 mL，充分震荡，于4 冰箱保存, 保存期不超过7天。 5.3.4 1倍电泳缓冲液 取5倍电泳缓冲液500 mL
7、，加去离子水2 000 mL，混匀。 5.3.5 加样缓冲液 DB63/T 14782016 3 称量EDTA 0.440 g，溴酚蓝0.250 g，二甲苯青 0.025 g，置于500 mL烧杯中，向烧杯中加入去离 子水20 mL，加热搅拌充分溶解，加入甘油18 mL后，使用NaOH调节pH值至7.0，用去离子水定容至50 mL， 室温保存。 5.4 染色试剂 5.4.1 10mg/mL 溴化乙锭 称量溴化乙锭0.50 g，加入到200 ml容器中，加入去离子水50 ml，充分搅拌完全溶解溴化乙锭， 将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 5.4.2 凝胶染色液 取10mg/mL溴化乙锭溶液1
8、0 L，加入400 mL的去离子水，混匀。 6 引物 SSR引物见附录B。 7 操作步骤 7.1 试样制备 青海扁茎早熟禾种子单粒发芽成苗。 7.2 DNA提取 DNA提取步骤如下： a) 将DNA提取液在65 水浴中预热； b) 剪取长度为5 cm幼苗，置于2.0 mL的离心管中，加入2颗直径为0.5 cm的玻璃珠，在组织 研磨仪上以频率为30次每秒研磨90秒； c) 加入600 L预热的DNA提取液，置于65 水浴锅中，恒温30分钟，每5分钟颠倒混匀一次。 水浴后置于室温下冷却； d) 加入600 L三氯甲烷/异戊醇混合液，混合均匀，置于20 恒温摇床，震荡20分钟，室温 下1 0000
9、r/m离心10分钟； e) 小心吸取上层水相，置于新的1.5 mL的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，置于-20 冰箱中冷冻4小时，小心勾取漂浮白色沉淀，置于1.5 mL的离心管中； f) 加入500 L 70%的乙醇上下颠倒混匀5 min，静置1 min，吸取乙醇弃之，重复此操作2次。 g) 风干白色沉淀，加入40 L的1倍DNA溶解液，置于4 冰箱，溶解24小时； h) 用紫外分光光度计测定DNA溶液A260值、A280值，A260/A280应在1.82.0之间。将DNA稀释到50 ng/L100 ng/L,置于-20 冰箱保存。 7.3 PCR反应体系及程序 7.3.1 PCR反应
10、体系 10PCR buffer 2.5 L，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 L，样品DNA 1 L，10 M SSR引物1 L，Taq 酶（5 U/L）0.3 L，加去离子水补足25 L作为反应体系。 DB63/T 14782016 4 7.3.2 PCR反应程序 PCR扩增程序如下，其中X 为选用引物的退火温度，见规范性附录B： a) 94 预变性5分钟； b) 94 变性30秒，X 退火30秒，72 延伸30秒。此步骤进行35个循环； c) 72 延伸10分钟； d) 4 保存。 7.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 7.4.1 玻璃板处理 用自来水将玻璃板冲洗干净，晾干，再用95%乙醇擦
11、洗一遍，干燥。 7.4.2 玻璃板组装 玻璃板彻底干燥后，将两块玻璃板放入塑料胶条内，封装完毕后，用夹子固定在电泳槽上。 7.4.3 封口 用1 000 L移液枪将1%的琼脂糖沿胶条注入，凝固30分钟。 7.4.4 灌胶 将30%的丙烯酰胺13.3 mL，去离子水26.4 mL，5倍电泳缓冲液10 mL，10%过硫酸铵溶液500 L，四 甲基乙二胺（TEMED）40 L，轻轻混匀，缓缓灌入玻璃胶室，待胶室灌满之后，插入配套样品梳，聚合 1小时。 7.4.5 预电泳 轻轻拔出样品梳，在电泳槽内倒入1倍电泳缓冲溶液至淹没较短的玻璃板，负极在上，正极在下接 通电路，打开电源100 W功率预电泳30
12、min，并赶走胶孔的气泡。 7.4.6 PCR扩增产物处理 在PCR产物中加入加样缓冲液2 L，混匀。 7.4.7 电泳 将处理后的PCR产物，用移液枪吸取5 L加入到胶孔中，150 W恒功率电泳，约1小时，关闭电源。 7.4.8 染色 拆下玻璃板，除去琼脂胶，将聚丙烯酰胺凝胶轻轻地从玻璃板剥离，放入凝胶染色液，染色10 min。 取出胶块，用清水冲洗1 min。 7.5 成像 将胶块置于凝胶成像分析仪中，记录结果并保存起来。 8 品种真实性鉴定 DB63/T 14782016 5 待测品种个体制备试样，以资料性附录B中的SSR引物进行PCR扩增，若被测样品中所有SSR标记位点 扩增条带与附录
13、C和附录D中描述一致，可判定为真实性青海扁茎早熟禾种子。 9 品种纯度检测 按照GB/T 3543.2的规定取样，取不少于100个待测个体制备试样进行纯度鉴定。 品种纯度（P）的数值以%表示（保留1位小数），按公式（1）计算： %100 1 2 N N P .(1) 式中： P品种纯度； N1检测种子数； N2判断为真实性的种子数。 DB63/T 14782016 6 A A 附 录 A （规范性附录） 主要仪器设备及试剂 A.1 主要仪器设备 PCR扩增仪、垂直板电泳槽、高压电泳仪（600 V连续可调，0 mA400 mA连续可调，额定输出功率 为100 W）、恒温水浴锅（0 100 ）、天
14、平（精度0.01 g、0.0001 g各一台）、磁力搅拌机、高 速台式离心机（14 000 r/ min）、高通量组织研磨仪、紫外分光光度计、紫外凝胶成像仪、高压灭菌 锅、酸度计、微量移液器（10 L、100 L、1 000 L）、冰箱、脱色槽。 A.2 主要试剂 乙二胺四乙酸二钠（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na2）、三羟甲基 氨基甲烷（hydroxymethyl aminomethane，Tris）、盐酸 (HCl)、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（ce
15、tyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、三氯甲烷 （chloroform）、异戊醇（isoamyl alcohol）、氢氧化钠 （NaOH）、液氮、四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs: dATP、dCTP、dGTP、dTTP）混合榕液、引物（primer）、Taq DNA聚合酶（Taq polymerase）、丙烯酰 胺（acrylamide）、甲叉双丙烯胺胶（N，N - methyleme bisacrylamide）、四甲基乙二胺（tetramethyl ethylenediamine ，TEMED）、过硫酸胺（ammonium persaliate，APS）
16、、硼酸（boric acid）、溴酚 兰（bromophenol blue）、二甲苯青（xylene cyanol）、溴化乙锭（ethidium bromide，EB）。 常规生化试剂等级要求为分析纯。 DB63/T 14782016 7 B B 附 录 B （规范性附录） SSR引物参数 图B.1 SSR引物参数 名称 序列 退火温度（） 分子量（bp） poap5 F GCTTCTTAGAATGGAGGTC R ATCAGAGGGAGATTTTGC 55 223 Poap9 F AGAGGAAAACTCTTCTCTCTG R GAAAGCAACAAGCACCT 55 154 Poap10
17、F TCGCTTGAGTTGCTGTAC R AAGGTTTCCAAATAGGCT 50 220 DB63/T 14782016 8 C C 附 录 C （资料性附录） 青海扁茎早熟禾SSR分子标记鉴定电泳图谱 C.1 青海扁茎早熟禾与其他早熟禾品种的SSR电泳图谱 注1：1 青海草地早熟禾；2 骑士；3 布鲁克；4 公园；5 世外桃源；6 肯塔基；7 武士；8 爱美；9 午夜；10 黑 珍珠；11 帝国； 12 奖品； 13 水晶； 14 优异； 15 勇士； 16 百斯特； 17 青海扁茎早熟禾； 18 青海 冷地早熟禾； M marker C.2 青海扁茎早熟禾品种群体鉴定SSR电泳图谱
18、 注2：M marker；青海扁茎早熟禾个体 SSR 标记鉴定（箭头所指为多态性条带） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 300bp 200bp poap10 200bp 300bp poap9 200bp 300bp Poap 5 poap9 poap10 200bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M 200bp DB63/T 14782016 9 D D 附 录 D （规范性附录） 青海扁茎早熟禾SSR分子标记鉴定模式图 D.1 青海扁茎早熟禾SSR分子标记鉴定模式图 _ 300bp 200bp Poap5 Marke r 300bp 200bp Poap9 Marker Poap10 300bp 200bp Marker 300bp 200bp Poap9 Marker
